为了实验设计的严谨、分析结果可靠、投稿顺利，微生物组测序需要设置生物学重复。
生物学重复能够能可以测量变异程度，够消除组内误差；降低背景差异，增强结果的可靠性；检测离群样本，异常样本的存在，会严重影响测序结果的准确性，通过计算样本间的相关性可以发现异常样本，将其排除。
自然环境至少3个生物学重复，一般推荐5个；若是人类的肠道、粪便等样品，由于个体特异性高，建议10个以上的重复。

微生物多样性测序与宏基因组测序均需准备DNA样品。
微生物多样性DNA送样要求：
DNA样品总量：单次建库的量m≥0.25μg，建议送2次建库的量，即m≥0.5μg；
DNA样品浓度：c＞5ng/μl，以Qubit质检结果为准；
DNA样品纯度：OD260/280在1.8~2.0之间；
DNA样品完整性：DNA无降解，即电泳有明显的主条带。
宏基因组DNA送样要求：
DNA样品总量：单次建库的量m≥2.5μg，建议送2次建库的量，即m≥5μg；
DNA样品浓度：c＞100ng/μl，以Qubit质检结果为准；
DNA样品纯度：OD260/280在1.8~2.0之间；
DNA样品完整性：DNA无降解，即电泳有明显的主条带。
样品邮寄时，应使用干冰或冰袋运送DNA样品，保证DNA样品的完整性。

调查文献发现16S测序会选择单V区（V4区）、双V区（V3-V4区或V4-V5区）以及三V区（V1-V3区、V4-V6区），但是并没有定论说测哪个区域更好。锐翌基因选择V3-V4区进行测序，原因有几下几点：引物序列设计覆盖率高；目标区域中已知物种种类较多；目标区域中物种测定准确率高；测序仪器读长限制。

取样时，尽量避免取到宿主部位；
DNA提取时，尽量去除杂质；
数据分析时，进行宿主数据库的比对，去除宿主污染的序列信息。

高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值用于衡量测序准确度。碱基的质量值为20，错误率为1%，30的错误率为0.1%。Q20与Q30则表示质量值大于等于20或30的碱基所占百分比。比如一共测了1G的数据量,其中有0.9G的碱基质量值大于或等于20,那么Q20则为90%。

将宏基因组denovo组装的序列按长度从大到小的顺序排序，依次累加序列的长度，当累加值第一次超过所有序列总长度的50%(90%)时，此时累加到的序列的长度值即为N50(N90)。相比序列平均长度，N50(N90)更能准确表示此次序列拼接的效果。

扩增子测序指16S、18S、ITS测序，主要用于研究环境样品中微生物的组成，性价比高，实用性强；宏基因组主要用来研究环境样品中的微生物组成、基因组成、功能基因等信息，深度挖掘环境样品潜在的功能。

数据库不同。16S使用的数据库是Sliva、Greengene或RDP数据库；宏基因组使用的是NCBI数据量；鉴定到不同水平上的物种的种类是不同的。16S在门、纲、目、科、属水平注释上的物种均多于宏基因组，而宏基因组仅在种水平注释上的物种组成显著多于16S。