锐翌基因协助浙江大学医学院在《Gut》发表了《Angiogenin maintains gut microbe homeostasis by balancing α-Proteobacteria and Lachnospiraceae》，其中16S rRNA基因测序和数据分析由锐翌基因完成。
导读
抗菌肽（AMP）在维持肠道健康中起着重要作用，并与IBD有关。血管生成素（ANG）是一种肠道分泌型AMP，具有很强的种特异性抗菌活性。本研究深入探索了抗菌肽-细菌-IBD的相互作用，并阐明其调控机制，为IBD的预防和治疗提供了新的实验依据。
文献ID
中文标题：血管生成素通过平衡α变形菌纲和毛螺菌科细菌维持肠道菌群稳态
原标题：Angiogenin maintains gut microbe homeostasis by balancing α-Proteobacteria and Lachnospiraceae
期刊名：Gut IF：19.819
年份：2020
通讯作者：许正平/盛静浩
通讯单位：浙江大学医学院
材料与方法
在不同的结肠炎模型中，采用同笼饲养和粪便菌群移植，评估了ANG对菌群和结肠炎的影响。通过16S rDNA测序确定受ANG调节的细菌，并通过细菌定植分析其在结肠炎中的功能。用微生物学和生化方法进一步研究了ANG的物种特异性抗菌活性及其潜在机理。在IBD粪便样本中进行ANG水平和关键细菌的分析。
研究成果
1、ANG通过维持健康的肠道菌群抑制结肠炎
为确认ANG与人类结肠炎的关系，研究者比较了45位健康受试者和64位IBD患者的ANG水平，发现疾病组的ANG水平显著低于健康对照组（图1A）。此外在DSS的处理下，Ang1−/−小鼠比野生型（WT）小鼠表现出更严重的结肠炎症状（图1C-F）。结合这些发现以及对ANG可以抗微生物并在潘氏细胞中高表达的认识，研究者假设ANG通过调节某些肠道微生物来抑制肠道炎症，因此进行了微生物干预实验。在进行 2.5% DSS处理之前，WT小鼠和年龄与性别相当的Ang1−/−小鼠（WT (co-Ang1−/−)），或者和衍生自Ang1+/-亲本的WT同窝仔（WT (co- WT)）共同饲养6周（图1B）。根据体重减轻、疾病活动指数（DAI）、结肠长度、组织学评分和细胞因子表达判断，WT（co-Ang1-/-）小鼠比未共存的WT或WT（co-WT）小鼠发生更严重的炎症（图1C-G），提示WT（co-Ang1-/-）小鼠结肠炎增强可能是由于食用Ang1-/-小鼠粪便引起肠道菌群变化所致。为了确认这种可能性，研究者进行了为期两周的每两天将年龄和性别相匹配的WT或Ang1-/-小鼠的粪便转移到经抗生素治疗的WT小鼠的胃肠道中（图1H）。与从WT同系小鼠接受粪便相比，从Ang1-/-小鼠接受粪便的野生型小鼠结肠炎的症状更为严重（图1I-M）。研究者还采用其他模型进一步确认假设，并得到相似的结果。这些数据揭示了ANG水平、肠道菌群和结肠炎严重程度这三者之间的关联，表明Ang1-/-小鼠对实验性结肠炎的敏感性增加与肠道菌群的变化有关。
图1 Ang1缺失加重结肠炎症状
2、Ang1缺失导致菌群失调
为了鉴定受ANG1调控的微生物，研究者对小鼠粪便进行了细菌16S rRNA基因高通量测序分析（相同的Ang1+/-双亲繁衍5代以上，对WT和Ang1-/-同窝幼崽进行粪便取样）。稀疏曲线用于衡量单个小鼠细菌的多样性，结果显示Ang1-/-小鼠与WT相比具有更丰富的微生物（图2A，p<0.05），并且有着独特的群落结构（图2B）。组内和组间距离的差异分析表明，WT与Ang1-/-小鼠之间的微生物群落结构差异显著大于各组组内的差异（图2C，根据图2B计算）。线性判别分析显示了一些在WT与Ang1-/-小鼠之间存在差异的物种（图2D）。Proteobacteri（门）尤其是α-Proteobacteria（纲）在Ang1-/-组中富集，而 Lachnospiraceae（科）在Ang1-/-组中显著低于WT组（图2D）。qPCR实验（图2E,F）和荧光原位杂交实验（图2G）进一步证实了这一发现。值得注意的是，这两种微生物在接受Ang1-/-小鼠粪便转移的WT和Il-10-/-小鼠中的水平和Ang1-/-小鼠相似（2H,I），进一步支持ANG1在塑造肠道菌群中的作用。
图2 Ang1缺失导致菌群失调
3、受ANG1调节的细菌与结肠炎有关
Ang1-/-小鼠对炎症的抵抗力增强与α-Proteobacteria增加但Lachnospiraceae水平降低之间的相关性表明，ANG可能是通过调节这两种肠道细菌的比例来预防结肠炎。研究者进一步分离得到了两个α-Proteobacteria菌种Brevundimonas diminuta （B. diminuta）和Sphingomonas paucimobilis（S. paucimobilis），以及两个Lachnospiraceae菌种，Anaerostipes species（Anaerostipes sp.）和Blautia species （Blautia sp.），作为受ANG1调控的菌种。为了确定它们与结肠炎的相关性，研究者首先检测了小鼠和人类粪便样本中这些菌种的水平。如图3A和B所示，与WT小鼠和健康受试人体相比，B. diminuta和S. paucimobilis的丰度在Ang1小鼠中分别增加了1.7和4.9倍，在IBD患者中分别增加了5.2和40.7倍，而Anaerostipes sp.和Blautia sp.在Ang1-/-小鼠中分别降低了2.6和3.2倍，在IBD患者中分别降低了9.8和5.3倍。为了确定这些细菌能否调节结肠炎，研究者将这些菌接种至WT和Ang1-/-小鼠14天，并在DSS处理前1周停止接种（图3C）。16S rRNA基因的qPCR实验证实了小鼠有较高的细菌定植效率（图3D）。有趣的是，DSS处理后，灌喂两种α-Proteobacteria菌的WT小鼠患上了更为严重的结肠炎，包括更显著的体重减轻、更高的DAI评分、更短的结肠长度和更严重的结肠组织病理学特征（图3E-H）。相反，灌喂两种Lachnospiraceae菌种可抑制Ang1-/-小鼠的结肠炎（图3I-L）。值得注意的是接种B. diminuta和S. paucimobilis的WT小鼠和Ang1-/-小鼠表型相似（图3E），而接种Anaerostipes sp.和Blautia sp.的Ang1-/-小鼠和WT小鼠在肠炎严重程度表型相似（图3I）。上述结果表明ANG1通过平衡α-Proteobacteria和Lachnospiraceae的水平来维持肠道微生物的群落结构和稳定性，从而起到预防结肠炎的作用。
图3 受ANG1调节的细菌与结肠炎有关
4、ANG通过压制α-Proteobacteria来增加Lachnospiraceae的丰度
为了了解ANG如何调节α-Proteobacteria的平衡，研究者检测了重组人ANG和小鼠ANG1对四种已鉴定细菌菌种的杀菌活性。通过血管生成和核糖核酸分析法证实了重组ANG和ANG1蛋白的生物学活性。ANG和ANG1对Lachnospiraceae的致死剂量中位数（LD50）是α-Proteobacteria的25-250倍（图4A），表明ANG对α-Proteobacteria具有选择性抗菌活性。为了解ANG的作用方式及其不同的杀菌活性机制，研究者探究了ANG对细胞RNA降解和细胞膜破坏的影响，这是ANG抑制细菌生长的两种已知机制。细胞RNA的降解需要其核糖核酸分解活性，因此本研究比较了WT和ANG的核糖核酸酶无活性变体（K40I）的抗菌能力，发现不需要核糖核酸分解活性（图4A），从而排除降解细菌RNA的杀菌机制。接着，研究者通过碘化丙啶（PI）染色检测ANG对细胞膜完整性的影响，结果表明ANG可增加膜的通透性（图4B）。进一步研究表明，ANG能够以剂量依赖性的方式破坏细菌膜（图4C）。用扫描电子显微镜检查细菌膜的形态，发现用低浓度的ANG或ANG1处理会改变膜结构，在B. diminuta中由光滑的表面变为气泡状层，在S. paucimobilis中由光滑的表面变为更大的气泡状结构（图4D）。相比之下，直到达到更高的浓度（10 µM ，ANG或ANG1），两种Lachnospiraceae菌种才发生有害的结构变化（图4D）。这些数据表明，ANG会优先透化B. diminuta和S. paucimobilis菌种的膜，导致细胞破坏。
图4 ANG的抗菌活性
免疫荧光分析（图5A）和pull down实验（图5B）显示，ANG和ANG1与B. diminuta和S. paucimobilis直接结合。粪便涂片染色显示，IBD患者（图5C）和大肠炎小鼠（图5D）的粪便中的ANG与α-Proteobacteria共定位并富集在其膜上。这些数据表明，ANG更喜欢结合B. diminuta和S. paucimobilis的膜来诱导它们的通透性。
越来越多的证据表明，共生细菌与细菌之间的相互作用有助于维持均匀的微生物组。为了解ANG介导的α-Proteobacteria的抑制是否是Lachnospiraceae增长的原因，研究者首先研究了α-Proteobacteria对Lachnospiraceae生长的潜在拮抗作用。在小鼠（图5E）和人（图5F）的粪便中，Lachnospiraceae的丰度与α-Proteobacteria呈负相关。此外B. diminuta和S. paucimobilis的培养基会抑制Anaerostipes sp.和Blautia sp.的生长（图5G,H），反之亦然（图5I,J）。
为了证实体外的研究成果，研究者检测了口服重组ANG1是否会影响Ang1-/-小鼠中的这些细菌（图5K）。结果表明内源的α-Proteobacteria（包括B. diminuta和S. paucimobilis）在ANG1的口服处理下持续下降，当停止处理时又得以恢复。与此同时，Lachnospiraceae的水平（包括Anaerostipes sp.和Blautia sp.）则呈现相反的趋势（图5L）。此外，研究发现在WT小鼠中补充这两种α-Proteobacteria显著抑制了内源性Lachnospiraceae的生长，而将这两株Lachnospiraceae菌接种到Ang1-/-小鼠则拮抗了内源的α-Proteobacteria（图3D）。这些数据表明ANG1抑制了α-Proteobacteria的生长，反过来又促进了Lachnospiraceae的生长。
以上结果表明ANG直接结合并致命性地透化了α-Proteobacteria的膜，因此有利于其拮抗对手Lachnospiraceae的生长。
图5 ANG通过压制α-Proteobacteria来增加Lachnospiraceae的丰度
5、 ANG1治疗可防止菌群失调并抑制Ang1-/-小鼠中DSS诱导的结肠炎
如图5L所示，口服重组ANG1可以改变Ang1-/-小鼠中α-Proteobacteria和Lachnospiraceae的比例，表明ANG在结肠炎中具有潜在的治疗作用。为探索这种可能性，研究者用ANG1口服治疗Ang1-/-小鼠30天，然后用DSS处理7天诱导结肠炎（图6A）。用ANG1预处理的小鼠表现出结肠炎的临床症状减弱，包括体重增加（图6B）、更长的结肠长度（图6C）、DAI减少（图6D）以及组织学评分降低（图6E）。结肠症状的改善伴随着α-Proteobacteria的减少和Lachnospiraceae的增加（图6F），表明菌群失调的逆转至少有部分是由于ANG1的治疗导致。
图6 ANG1治疗可防止菌群失调并抑制Ang1-/-小鼠中DSS诱导的结肠炎
研究结论
本研究证明ANG在塑造肠道微生物组成并因此维持肠道健康方面的新作用（其工作模型如图7所示），表明ANG-菌群轴可以发展为与菌群失调相关的肠道疾病的潜在预防或治疗方法。
图7 ANG在维持肠道微生物稳态以预防结肠炎中的工作模型
