锐翌基因协助上海交通大学医学院附属新华医院在《Clinical and Translational Medicine》发表了《A metagenomic study of biliary microbiome change along the cholecystitis-carcinoma sequence》，其中宏基因组测序和数据分析工作由锐翌基因完成。
导读
胆囊癌（GBC）是一种高侵袭性癌症，也是胆道系统最常见的癌症类型。GBC患者预后极差，12个月中位和5年生存率低于5%。手术切除是目前治疗GBC的唯一选择。然而，大多数患者由于隐藏的临床症状和缺乏特异性生物标志物，诊断即晚期，已经失去了接受切除手术的可能性。目前GBC的发病机制尚不清楚。遗传易感性、感染因素和生活方式被认为是GBC发生的原因之一。同时，研究发现慢性结石性胆囊炎（CCC）和GBC的发病率增加有关系。了解CCC和癌变的关系有助于预防和治疗GBC。在这项研究中，研究人员试图呈现慢性胆囊炎黏膜向恶性病变过渡期间患者胆道微生物组的剖面图。
文献ID
英文标题：A metagenomic study of biliary microbiome change along the cholecystitis-carcinoma sequence
中文标题：宏基因组学研究胆囊炎-癌转化过程中的胆道微生物组变化
杂志：Clinical and Translational Medicine
发表时间：2020年5月 IF：7.919
通讯单位：上海交通大学医学院附属新华医院
材料与方法
1）样本收集：GBC黏膜标本由7个接受胆囊癌根治术的患者提供（没有做过化疗和放疗），CCC黏膜标本由7个接受腹腔镜胆囊切除术的患者提供。同时收集和记录患者的临床指标数据。苏木精和伊红（H&E）染色证实了GBC和CCC的诊断。粘膜活检标本的取样量至少是0.5厘米。取完样本后迅速用液氮冷冻，并储存在-80℃环境中。
2）DNA提取。提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）
3）宏基因组测序。测序平台Illumina Hiseq X10，每个样本10G数据量。
研究成果
1、CCC和GBC患者胆道微生物群组成变化
研究发现，两组人群在年龄、性别、胆结石数量、CCC持续时间等方面无显著性差异。物种组成柱状图显示两组人群微生物结构不同（图1E）。进一步用PCoA分析比较组间微生物结构，证明存在显著性差异（图1A）。而厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门在两组中共存（图1B-C），说明其稳定性。α多样性分析表明，CCC组胆道微生物的多样性和均匀性显著低于GBC组（图1D）。通过LEfSe分析筛选组间具有显著差异的微生物，共找到25个物种（图1F）。属水平上，basidioascus、消化链球菌属、靴耳属、梭菌属之间存在正相关关系；种水平上，Peptostreptococcus stomatis、Fusobacterium mortiferum、Acinetobacter junii和Enterococcus faecium之间存在正相关关系，并且在GBC组中显著富集。
图1 慢性结石性胆囊炎和胆囊癌患者胆道微生物组成变化
2、CCC和GBC患者微生物基因功能的差异
采用Bray - Curtis 距离进行的Anosim试验表明，CCC组和GBC组的胆道菌群组成存在明显差异（图2A）。进一步作基因功能注释分析，结果表明，NAD发育蛋白脱乙酰酶、脱氧核糖核酸酶V、支链氨基酸转运系统透性酶蛋白、分支酸变位酶在GBC组中显著富集，而古细菌活性腺苷甲硫胺酸以及一些假想蛋白在CCC组中显著富集（图2B）。将19927个基因与KEGG数据库进行比对，发现大多数基因参与新陈代谢活动，特别是能量和碳水化合物的新陈代谢（图2C）。PCA、PCoA分析结果表明KOs相对丰度也存在组间差异（图2D）。GBC组中大部分KOs的相对丰度较低，虽然CCC-05的结果与GBC组相似，但研究人员猜测它更容易因严重的炎症而发生恶性变化（图2E）。
图2 慢性结石性胆囊炎和胆囊癌患者的微生物基因功能差异
3、CCC和GBC组的MGS图谱
通过MGS分析发现，两组中共有2543个微生物基因相对丰度显著不同。随后的相对丰度分析鉴定了10个MGSs，其中4个在GBC组中富集，另外6个在CCC组中富集（图3A）。CCC和GBC组的MGS之间呈显著负相关关系，表明两组之间存在差异（图3B）。
图3 慢性结石性胆囊炎和胆囊癌患者的MGS分析
4、CCC和GBC组差异微生物互作分析
为了评估差异微生物之间的互作关系，文中创建了一个共丰度和共排斥关系的SparCC网络图。从图4可以看出，两组人群各形成自己的互作网络，而这两个网络图明显不同。GBC组菌群间的显著相关对数和相关强度均高于CCC组菌群。上述结果表明这些微生物之间存在着复杂的互作网络，但这些相互作用还需要进一步研究。
图4 慢性结石性胆囊和胆囊癌组差异微生物互作分析
5、CCC和GBC组微生物参与的碳水化合物活性酶差异
研究发现，胆道微生物中碳水化合物代谢水平很高。用contigs与碳水化合物活性酶（CAZymes）数据库进行比对，以分析其在CCC和GBC组中的功能差异。Anosim分析证明碳水化合物酶在两组间存在显著差异（P=0.001）（图5A）。CCC组比GBC组拥有更高的碳水化合物活性酶多样性（图5B）。LEfSe分析表明GHs、GTs、PLs、GEs在CCC组中显著富集，而GT77在GBC组中显著富集。上述结果说明CCC组碳水化合物代谢能力降低。
图5 慢性结石性胆囊炎和胆囊癌患者中碳水化合物活性酶（CAZymes）功能差异
研究结论
总的来说，该研究发现了CCC患者和GBC患者胆汁菌群的组成差异，并比较了菌群结构和功能与疾病发病机制的关系。虽然队列数量有限，但该研究通过阐明GBC发展过程中粘膜群落组成的变化，帮助人们进一步理解了GBC肿瘤发生的机制。但是目前的研究还远远不够，未来需要进行基因组学分析，以探索免疫细胞群、宿主细胞表观基因组和微生物群落之间的相互作用，这对确定胆道微生物群在人类健康和疾病中的多方面作用至关重要。
亮点
首次鉴定了人胆道粘膜的微生物群特征，并比较了慢性结石性胆囊炎和胆囊癌患者的微生物群落结构和功能差异。该研究结果有助于加深人们对参与胆囊癌发展过程的不同微生物群落的复杂环境的理解。
