2020-05-26浏览量:681

『锐翌成果展』母体摄入三氯蔗糖会改变子代肠道菌群,并加剧成年期肝脂肪变性

锐翌基因协助天津医科大学总医院在《Gut Microbes》发表了《Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbates hepatic steatosis in adulthood》,其中16S rRNA基因测序由锐翌基因完成

 

 

导读

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是最常见的慢性肝病之一,被认为与饮食和肠道菌群失调有关。三氯蔗糖是一种有机氯人工甜味剂,它被越来越多地添加到日常食用的食品中,如软饮料、谷类食品和无糖甜点。然而,越来越多的证据表明,过量的三氯蔗糖可引起肠道菌群失调,对宿主健康产生不利影响。而母体的饮食决定了新生儿的微生物群落,这种影响在子代的生活中还会继续。本研究旨在探讨母体摄入三氯蔗糖(maternal sucralose,MS)对子代成年期肝脂肪变性易感性的影响。

 

 

文献ID

英文题目:Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbates hepatic steatosis in adulthood

中文题目:母体摄入三氯蔗糖会改变子代肠道菌群,并加剧成年期肝脂肪变性

发表期刊:《Gut Microbes》      IF:7.823

发表时间:2020/3/31

通讯作者:王邦茂、曹海龙

通讯单位:天津医科大学总医院

 

 

材料与方法

将C57BL/6孕鼠随机分为MS组(妊娠期和哺乳期摄入MS)和母系对照组(MC组)。断奶后,所有的幼仔在8周龄之前都以标准饮食喂养,然后用高脂饮食(HFD)喂养4周。对3周龄的幼鼠进行肠道发育、粘膜屏障功能和肠道菌群的检测。此外,在第12周评估肝脂肪变性的严重程度、血清生化、脂质代谢和肠道微生物组成等。

图1a 实验流程图

 

 

研究成果

1、MS抑制3周龄幼鼠的肠道发育,破坏肠道屏障

在本研究中,幼鼠的性别比例和总产仔数在MS组和MC组之间没有显著差异,且两组均未发现死亡。除MS组子代在2~4周龄时体重明显高于MC组外,其余8周龄测定时间点两组子代体重基本一致。但在HFD 15天后,MS组子代体重明显高于MC组。因此,补充MS可轻微增加断奶期子代体重,显著加重HFD幼鼠的体重(图1b)。

 

在小鼠出生后第三周之前,胃肠道的发育主要受母体营养的影响。本文研究了三氯蔗糖对3周龄幼鼠肠道发育和肠道屏障完整性的影响。MS组3周龄幼鼠的绒毛长度和隐窝深度明显小于MC组(图1c-d)。与MC组比较,MS组Ki67阳性增殖细胞数减少(图2a)。同时,高碘酸希夫(PAS)阳性细胞(杯状细胞)数量也减少(图2b)。MUC2是杯状细胞最重要的产物之一,与黏液层的形成密切相关。根据MUC2阳性细胞的数量和mRNA的表达,与MC组相比,MUC2的表达量下调(图2c-d)。紧密连接蛋白包括ZO-1、Claudin-1、Claudin-3和Occludin被认为是决定肠道屏障完整性的最重要因素。PCR数据显示,MS组Claudin-1、Claudin-3、ZO-1表达明显降低,Occludin表达与MS组相似(图3a)。此外,免疫荧光也提示MS组中ZO-1蛋白表达下降(图3b)。免疫球蛋白A(IgA)在肠道免疫屏障功能中起着关键作用,可以抑制病原体的粘附。IgA免疫荧光显示,MS可显著降低IgA在小肠的表达水平(图3c-d),提示MS可抑制幼鼠早期肠道发育,破坏肠道屏障的完整性。

 

通过H&E染色发现,两组幼鼠小肠和结肠没有明显的炎症反应(图1c)。进一步评估促炎细胞因子的水平,包括IL-1β,IFN-γ和结肠组织TNF-α。发现MS 组中这些促炎细胞因子mRNA 表达水平明显高于MC组(图2e)。结果表明,摄入MS可引起子代肠道轻度炎症,损伤肠道屏障功能。

 

图1b-d 母鼠摄入三氯蔗糖抑制了3周龄幼鼠的肠道发育

 

图2 母鼠摄入三氯蔗糖扰乱幼鼠肠道增殖和分化,并诱发3周龄幼鼠结肠轻度炎症

 

图3 母鼠摄入三氯蔗糖破坏幼鼠结肠的紧密连接,并使3周龄幼鼠小肠IgA减少

 

2、MS改变了3周龄幼鼠肠道微生物组成

通过16s rRNA测序对3周龄子代肠道菌群组成和结构进行分析。Venn图显示,MC组共356个OTU,MS组共281个OTU,两组共同拥有268个OTU(图4a)。分析两组的微生物群落结构发现,门水平优势物种分别是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。MS组疣微菌门和变形菌门的相对丰度随着拟杆菌门的减少而升高。在属水平,MS组与MC组之间存在显著差异的属主要有:AkkermansiaAlistipesBarnesiellaBlautia、棒状杆菌属(Corynebacterium)、ParaprevotellaRobinsoniellaSaccharibacteria_genera_inc-ertaesedis、链球菌属(Streptococcus)。与MC相比,MS组AkkermansiaBlautia、棒状杆菌属和Robinsoniella显著增加;同时,AlistipesBarnesiellaParaprevotellaSaccharibacteria_genera_incertae_sedis和链球菌属减少(图4b)。

 

通过Shannon和Simpson多样性指数评估3周龄幼鼠的微生物alpha多样性。MS显著降低了alpha多样性(图4c)。通过主坐标(PCoA)分析和Adonis检验对非加权 UniFrac 距离进行计算,计算两组样本间的差异。结果表明,MS对3周龄幼鼠的微生物组成有显著影响(图4d)。

 

图4 母体摄入三氯蔗糖改变了3周龄幼鼠肠道微生物组成

 

通过LEFSe差异分析两组细菌在门、纲、目、科、属水平上的丰度差异(图5a)。差异物种丰度热图如图5b所示。其中MS组抗炎相关的Alistipes相对丰度较低。Parabacteroides(一种能调节宿主代谢、减轻肥胖和代谢功能障碍的菌属),在MS组中显著降低。而与肥胖和代谢紊乱高度相关的Blautia在MS组中显著升高。此外,在MS组中,疣微菌门的Akkermansia(一种降解黏液的菌)相对丰度增加,这可能是由于3周龄子代黏膜屏障功能的破坏和炎症反应的增加。与MS组肠道轻度炎症增加相一致,埃希氏杆菌属(Escherichia)/志贺氏杆菌(Shigella)和Anaerostipes在炎症性肠病和代谢紊乱中更为丰富的菌,在MS组中增加。链球菌和瘤胃球菌在MS组中减少,以往的研究中发现,这两种菌与炎症呈负相关。此外, MS 组产丁酸盐细菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis,普雷沃氏菌(Prevotellaceae)和Clostridium XlVa显著减少。这些结果表明,在孕期和哺乳期摄入MS可扰乱子代的肠道微生物组成。

 

图5 母鼠摄入三氯蔗糖改变了3周龄幼鼠体内关键细菌和SCFAs的产生

 

3、MS降低了3周龄幼鼠盲肠内短链脂肪酸(SCFAs)含量

碳水化合物细菌发酵可产生醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐等肠道SCFAs。已有研究报道肠道屏障功能与肠道SCFAs浓度呈正相关。在本研究中,MS组的丁酸盐产量明显低于MC组,乙酸和丙酸盐产量也有下降的趋势(图5c)。上述发现以及上述微生物组成的变化提示,产生SCFAs的细菌数量的减少和丁酸盐产量的下降可能与MS摄入导致肠道发育的抑制和肠道屏障的破坏有关。

 

4、MS加重了HFD诱导的成年小鼠肝脂肪变性

越来越多的研究表明,早期肠道微生物失衡和慢性炎症可能与成年期的不良后果有关。本文研究了早期摄入MS是否会增加成年期肝脂肪变性的风险。总的来说,MS组肝脏颜色为淡黄色,而MC组肝脏颜色为暗红色(图6a)。MS组肝脏及腹部脂肪组织重量较MC组明显增加(图6b)。与MC组相比,MS 组丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶显著增加 。此外,MS组血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明显升高(图6c)。

 

H&E染色证实,两组12周龄幼鼠均有明显的脂肪肝。MS组脂肪变性较严重,炎性细胞大量浸润,出现部分片状坏死。同时,MS组NAFLD活性评分(NAS)也显著高于MC组(图6d)。MS组肝脏的炎性细胞因子IL- 6和TNF-α等也升高(图6e)。

 

与MC组相比,MS组FasnAcaca等脂肪酸合成基因表达水平升高,胆汁酸合成限制酶Cyp7a1基因被抑制,肝脏中调节胆汁酸合成的关键基因shp显著上调(图6f)。这些基因表达的改变提示了MS干扰脂肪酸和胆汁酸的生物合成和代谢。

 

图6 母体摄入三氯蔗糖会加重12周龄幼鼠HFD诱导的肝脂肪变性

 

5、HFD加重了成年小鼠的菌群失调

本文重点研究了HFD 4周后,MS组和MC组肠道菌群变化。MS组共336个OTU, MC组共285个OTU,两组共同拥有269个OTU(图7a)。与HFD前相比,两组中厚壁菌门和变形杆菌门的相对丰度均升高,而拟杆菌门的相对丰度均降低。然而HFD 9周后,MS组变形菌门的丰度比MC组下降得更明显(图7b)。

 

两组间Shannon和Simpson多样性指数(alpha多样性)无显著差异(图7c)。在beta多样性方面,Adonis分析显示两组之间存在显著差异(图7d)。基于未加权UniFrac距离的3周龄和12周龄子代的PCoA分析显示,HFD确实部分稀释了MS驱动的肠道菌群的差异(图7e)。总之,本文研究结果表明,HFD严重加剧了后代肠道菌群的失调。然而,即使在HFD 4周后,MS组的肠道菌群与MC组仍有部分差异。

 

图7 母体摄入三氯蔗糖加重12周龄幼鼠肠道发育不良

 

6、MS使3周龄幼鼠的GPR43表达量降低

有报道称,丁酸盐可激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCRs),包括在肠上皮细胞和脂肪细胞上表达的GPR41、GPR43和GPR109A。这些GPCRs的激活似乎可以通过多种机制缓解NAFLD的进展。通过免疫组织化学方法检测3周龄子代结肠中GPR41、GPR43和GPR109A的表达发现,在MS组和MC组中,GPR41、GPR43和GPR109A均在结肠组织中表达。然而,MS组结肠中GPR43的表达明显低于MC组,并伴有产丁酸盐细菌和丁酸盐的减少(图8a)。Real-time-PCR数据也显示,3周龄子代结肠组织中GPR43的相对表达量较MC组下降(图8b)。

 

7、丁酸梭菌通过体外激活GPR43降低炎性细胞因子的产生

与对照组相比,丁酸盐和丁酸梭菌上清液刺激HCT116细胞后,GPR43 mRNA水平分别上调2.2倍和2.8倍,GPR109A mRNA水平分别上调2.9倍和2.1倍,但GPR41 mRNA表达无明显变化。同时,丁酸梭菌上清液和丁酸盐分别使TNF-α的表达下降26.3%和36.1%。此外,通过RNA干扰技术研究了丁酸梭菌的抗炎功能是否依赖于GPR43。沉默GPR43抑制了丁酸梭菌介导的TNF-α 表达量下调。在HCT8细胞中也出现了类似的结果(图8c-g)。这些结果表明,丁酸梭菌通过激活GPR43具有抗炎作用。

 

图8 丁酸梭菌通过激活GPR43降低炎性细胞因子的产生

 

 

研究结论

1、MS抑制3周龄幼鼠的肠道发育,破坏肠道屏障,导致肠道轻度炎症。

2、MS对3周龄幼鼠肠道的微生物组成有显著影响,且HFD可显著加重成年小鼠的菌群失调。

3、MS干扰成年小鼠的脂肪代谢,加重了HFD诱导的肝脂肪变性。

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