2020-01-15浏览量:781

『锐翌成果展』小柳原田综合征(VKH)患者肠道微生物组成的改变

2020年1月13日,锐翌基因与重庆医科大学附属第一医院在《GUT MICROBES》上合作发表研究成果《Altered gut microbiome composition in patients with Vogt-Koyanagi-Harada disease》,锐翌生物创始人秦楠博士为文章共同通讯作者

 

导读

小柳原田综合征(Vogt-Koyanagi-Harada,VKH)是一种以双眼肉芽肿性全葡萄膜炎为特征的多系统自身免疫性疾病。肠道菌群一直被认为在该病的发病过程中起着重要作用,但肠道菌群的改变是否参与了该病的发病过程尚不清楚。为研究VKH疾病中肠道微生物组成的特征,本研究通过宏基因组测序技术,分析了VKH患者肠道菌群的物种图谱和代谢途径,构建了有助于疾病诊断和预后的微生物相关标记基因集;通过粪菌移植(FMT)实验,发现VKH患者肠道菌群显著加重了实验性葡萄膜炎动物模型的眼部炎症。

 

文献ID

题目:Altered gut microbiome composition in patients with Vogt-Koyanagi-Harada disease

译名:小柳原田综合征(VKH)患者肠道微生物组成的改变

发表期刊:《GUT MICROBES》  IF:7.823

发表时间:2020年1月13日

第一作者:叶子、吴春燕

通讯作者:杨培增、秦楠

 

实验设计及技术路线

本研究共纳入149名个体(71例未接受治疗的活动期VKH患者,11例接受系统性皮质类固醇联合其他免疫抑制剂治疗的非活动期VKH患者,67例健康对照)。诊断VKH疾病严格按照国际命名委员会修订的VKH疾病诊断标准。

 

排除标准:患有其他疾病如糖尿病、心血管疾病和传染病,以及在研究后一个月内服用抗生素或益生菌的患者被排除在外。

 

研究成果

1、VKH患者肠道菌群失调

活动期VKH患者与健康对照组肠道菌群的α多样性(Shannon index,observed species,P>0.05)和β多样性(Bray-Curtis 距离度量;ANOSIM,P>0.05)没有显著性差异(P>0.05)。但两组间微生物组成存在明显不同。在属水平上,VKH患者的Ramularia(柱隔孢属)、Alternaria(链格孢属)和Rhizophagus丰度增加,而Methanoculleus(甲烷囊菌属)、Candidatus MethanomethylophilusAzospirillum(固氮螺菌属)则减少(图1a)。柱隔孢属的R. collo-cygni和链格孢属的A. alternata被确定为VKH富集的物种,两个梭菌 (Clostridium sp. CAG:813Clostridium sp. CAG:349),甲烷囊菌属的Methanoculleus sp. CAG:1088Candidatus Methanomethylophilus属的Candidatus Methanomethylophilus alvus和固氮螺菌属的Azospirillum sp. CAG:260被确定为VKH减少的物种(图1b)。

 

LEfSe分析进一步验证了活动期VKH患者和健康对照组之间的不同微生物特征,并显示出类似的结果。尤其是,Paraprevotella spp.Paraprevotella clara CAG116Paraprevotella_clara)在活动期VKH患者中富集,而梭菌属(Clostridium sp. CAG:349Clostridium sp. CAG:813),双歧杆菌属(Bifidobacterium sp. MSTE12Bifidobacterium dentium),Candidatus Methanomethylophilus alvusMethanoculleus sp. CAG:1088减少(图1c)。 

 

图1 VKH与健康对照组之间的差异物种

 

2、VKH患者不同肠型肠道菌群失调

为了研究VKH患者肠道菌群的失调是否也存在于肠型亚群中,研究确定了VKH患者和健康对照组中丰度最高的前20个属。根据属的相对丰度,通过层次聚类分析,确定VKH患者和健康对照组的三种肠型。Cluster 1的特征是混合的菌属,包括Bacteroides(拟杆菌属), Prevotella(普氏菌属),AlisipesParabacteroides。Cluster 2是高丰度的拟杆菌属和低丰度的普氏杆菌属。Cluster 3的特征是普氏杆菌相对丰度高,而拟杆菌的丰度低。结果表明,VKH患者于对照组的三种肠型分布无显著差异(P=0.34)。

 

通过LEfSe分析,确定VKH患者和对照组之间三种肠型的微生物组成差异。所有VKH患者中都鉴定到的VKH减少的物种,包括梭菌属(Clostridium sp. CAG:349Clostridium sp. CAG:813),双歧杆菌属(Bifidobacterium sp. MSTE12Bifidobacterium dentium),Candidatus Methanomethylophilus alvusMethanoculleus sp. CAG:1088在Cluster 1混合肠型(Mix enterotype)的患者中丰度也减少。Cluster 2拟杆菌肠型中,在活动期VKH患者中确定了一个富集菌属Paracteroides sp. CAG2和减少的Alistipes属 (Alistipes sp. AL.1Alistipes sp. 400CAG:29),Proteobacteria bacterium CAG:495Eubacterium sp. CAG:115Roseburia sp.CAG:380,这与所有患者的LEfSe分析结果一致。在Cluster 3,普氏菌肠型VKH患者中,有部分Parabacteroides spp.Parabacteroides 405 sp.2.1.7Parabacteroides sp.D25),拟杆菌属(Bacteroides coprocola CAG:162Bacteroides thetaiotaomicron CAG:40)富集(图2)。

 

图2 3种肠型中,VKH患者和健康对照组物种LEfSe差异分析

 

3、VKH患者肠道菌群功能障碍

为研究肠道微生物在VKH疾病中的功能作用,我们构建了来自VKH患者和健康对照组1718179个非冗余基因的基因集,并使用KEGG和eggNOG进行功能注释。LEfSe分析显示,活动期VKH患者与健康对照组之间有6个KEGG orthologues (KO)和6个eggNOG orthologues (OG)存在显著差异。在代谢途径水平上,VKH活动期患者中富集了10条代谢途径,包括氧化磷酸化(ko00190)和脂多糖生物合成(ko00540)。此外,在VKH活动期患者中,有54个模块包括脂多糖生物合成(M00060)、VI型分泌系统(M00334)、乙酰辅酶A还原途径(M00377) 更为丰富(图3)。

 

图3 VKH和健康对照组以及治疗前后患者KO模块

 

4、VKH患者肠道微生物组成的改变与HLA-DRA有关

我们之前的研究确定了VKH疾病的三个易感基因位点,包括IL-23R-C1orf141、ADO-ZNF365-EGR2和HLA-DRA/HLA-DRB1。为研究这些易感基因型与肠道菌群组成之间是否存在相关性,我们根据这三个易感位点的6个主要SNP对54例VKH患者进行基因分型。将VKH患者分为具有和不具有风险等位基因的两组。LEfSe分析比较两组间的微生物组成。结果表明,HLA-DRA风险等位基因与2个VKH富集物种(Bacteroides sp.2.1.33BParaprevotella clara)呈正相关,与2个VKH减少物种(Alistipes finegoldiiEubacterium eligens)呈负相关。没有观察到肠道微生物组成与IL-23R-C1orf141、HLA-DRB1或ADO-ZNF365-EGR2之间的相关性。

 

5、免疫抑制治疗部分改变了VKH患者的肠道菌群

免疫抑制剂用于治疗VKH疾病,并已被证明能有效控制眼部炎症。采用LEfSe分析方法,探讨免疫抑制治疗对11例VKH患者在接受系统糖皮质激素联合环孢素A治疗前后肠道微生物组成的影响。结果表明,与治疗前相比,治疗后9个属和27个种富集,15个种减少。在这些差异特征中,VKH富集的物种,嗜酸链球菌Acidaminococcus sp.BV3L6在治疗后显著降低,而3种VKH减少菌,变形杆菌Proteobacteria bacterium CAG495、固氮螺菌属Azospirillum sp.CAG260Alistipes sp.CAG435显著升高。进一步分析治疗后微生物组功能的改变。与治疗前相比,VKH患者治疗后36个模块富集,35个模块减少。在这些患者治疗前后出现显著差异的模块中,3个VKH减少模块增加,2个VKH富集模块减少(图3)。总之,对治疗的响应反映了菌群与VKH的联系。

 

为检验肠道菌群是否与治疗反应相关,结合50例VKH患者治疗后的临床资料,然后比较了非活动期眼部炎症患者(30例)和治疗后复发性眼部炎症患者(20例)的肠道菌群。LEfSe分析发现这两组中有70个物种存在差异。其中,5个Alistipes sp.Bacteroides sp. UW对治疗反应良好(图5a)。

 

6、VKH疾病肠道微生物标记谱的建立

为了建立VKH疾病肠道微生物组的标记谱,使用了包括55名VKH患者和52名健康对照者的训练集构建SVM分类器,该分类器包含40个物种。AUC曲线下面积为89.16%,95% CI为83.37%-94.95%(图4b)。该分类器也在16例VKH患者和15例对照组中进行了验证。结果显示AUC值为83.75% (95% CI: 69.74%-97.76%),表明这些标记物在鉴别VKH患者与健康对照组中的有效性(图4c)。

 

另一种基于37种炎症预后相关物种的标记微生物SVM分类器(图5b)。结果表明,该分类器能够区分预后良好的患者与复发的患者(AUC = 93.65%,95% CI = 86.87%-100%)(图5c)。

 

图4 用于区分VKH患者与健康对照组的分类器

 

图5 用来预测预后的物种

 

7、VKH患者肠道菌群移植加重实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)

为研究VKH患者的肠道微生物组成是否有助于该病的发展,研究检测了粪菌移植(FMT)对EAU病程的影响(EAU是一种包括VKH疾病在内的、与人类葡萄膜炎有许多相似特征的动物模型)。我们首先对来自抗生素处理的小鼠粪便样本和人粪便定植小鼠的粪便样本进行了16S rRNA基因序列分析。Shannon多样性指数(图6a)和PCoA 分析(图6b)显示,经抗生素处理的小鼠微生物多样性极低,人粪便定植小鼠的肠道微生物表型与经抗生素处理的小鼠完全不同。此外,与粪菌移植健康受体小鼠相比,VKH减少菌属Alistipes在VKH受体小鼠中也减少。

 

VKH受体组成功诱导出EAU后,视网膜蛋白肽IRBP161-180与弗氏佐剂(CFA)完全免疫结合,临床表现包括结膜充血、睫状充血、角膜水肿、虹膜后粘连、前房闪辉和细胞(临床评分:3.5 ~ 5)(图6c)。对照组(临床评分:0 ~ 1.5)和PBS处理组(临床评分:0 ~ 0.5)中有1例轻微葡萄膜炎伴有结膜充血(临床评分:0 ~ 1.5)(图6e)。组织学分析还显示,VKH受体组眼部有显著病理改变,表现为视网膜结构紊乱,如严重的视网膜折叠和剥离,视网膜及脉络膜上大量炎性细胞渗出,以及视网膜血管炎(组织学评分:2到4)(图6d)。然而,对照组(图6f)和PBS处理组(图6h)没有或很少观察到视网膜结构的异常(组织学得分:0到1)。我们的临床和组织学结果显示,VKH受体组的得分显著高于对照组以及PBS处理组(图6j)。

 

图6 应用VKH患者菌群FMT对EAU的影响

 

研究结论

1、在活动期VKH患者(包括混合肠型和拟杆菌肠型VKH患者)中,均发现了产丁酸盐细菌、产乳酸细菌和产甲烷菌,以及丰富的革兰氏阴性细菌。免疫抑制治疗后VKH患者肠道菌群部分恢复。

2、HLA-DRA易感基因型与Bacteroides sp.2.1.33BParaprevotella claraAlistipes finegoldiiEubacterium eligens有关。

3、建立了包括40种疾病相关物种的微生物标记谱,以区分患者和对照组。另一种微生物标记谱包括37种与治疗反应相关的物种。

4、VKH患者肠道菌群的移植可显著加剧实验性葡萄膜炎动物模型的疾病特征。

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