2020-01-03浏览量:225

『锐翌成果展』丁酸梭菌可调控肠道菌群并抑制肠道肿瘤的发展

锐翌基因协助天津医科大学总医院在《Cancer Letters》发表了《Clostridium butyricum, a butyrate-producing probiotic, inhibits intestinal tumor development through modulating Wnt signaling and gut microbiota》,其中16S测序由锐翌基因完成

 

导读

肠道菌群失调与肠癌密切相关。在结直肠癌(CRC)患者中,可以观察到产生丁酸的细菌显著减少。但是,产生丁酸的细菌影响癌症发展的机制并不明确。本文章中,通过用丁酸梭菌干预高脂饮食诱导的Apcmin/+小鼠,以及结直肠癌细胞,研究丁酸梭菌对肠道肿瘤的影响。研究结果表明,丁酸梭菌可以通过调节Wnt信号转导通路和肠道菌群来抑制肠道肿瘤的发展,为CRC的治疗提供了新的思路。

 

文献ID

题目:Clostridium butyricum, a butyrate-producing probiotic, inhibits intestinal tumor development through modulating Wnt signaling and gut microbiota

译文:丁酸梭菌可调控肠道菌群并抑制肠道肿瘤的发展

期刊名:《Cancer Letters》  IF:6.508

年份:2019年11月

第一作者:陈丹凤,金多晨,黄淑敏

通讯作者:曹海龙和王邦茂教授

单位:天津医科大学总医院

 

材料与方法

实验设计

Apcmin/+小鼠分为3组:HFD-CB组(高脂饮食,饲喂丁酸梭菌),HFD-PBS组(高脂饮食,灌服PBS),BD-PBS组(基础饮食,灌服PBS)

CRC细胞(HCT116和Caco-2):用丁酸梭菌上清液或不同浓度的丁酸钠处理

 

高通量测序及代谢检测手段

16S rDNA测序:Illumina PE250

胆汁酸检测:LC-MS

短链脂肪酸检测:GC-MS

 

研究成果

1、丁酸梭菌抑制HFD诱导的Apcmin/+小鼠中肠道肿瘤的发展

不同处理的小鼠肠道肿瘤总数可以看出,HFD导致肠道肿瘤总数显著增加(20.9±3.78 vs 11.6±2.2,P<0.01),而丁酸梭菌抑制肠道肿瘤的形成(15±2.10,P<0.01)(图1B)。HFD-CB组的结肠肿瘤数量低于HFD-PBS组(1.2±0.87 vs 2.8±1.33,P<0.01)(图1C)。同时,在HFD-PBS组的小鼠中,有70%可以观察到结肠的高级别异型增生,而用丁酸梭菌处理的Apcmin/+小鼠则发展为有/没有低度异型增生的腺瘤(图1F-1I)。

图1 丁酸梭菌抑制HFD诱导的Apcmin/+小鼠肠道肿瘤的发展

 

2、丁酸梭菌抑制肠肿瘤细胞增殖并促进其凋亡

随后,研究评估了丁酸梭菌上清液是否可以抑制CRC细胞的增殖。与对照组相比,丁酸梭菌上清液浓度为20%时,HTC116细胞的活力随时间显著降低(P<0.001),Caco-2细胞的活力在48小时和72小时有明显下降(P<0.001)(图2A)。之后,选择了浓度为20%的丁酸梭菌上清液和1 mmol / L丁酸钠用于细胞处理。将小鼠肠道肿瘤细胞的增殖和凋亡分别通过Ki-67免疫组织化学和TUNEL分析定量。与HFD-PBS组相比,丁酸梭菌治疗组的Ki-67阳性率显著降低(20.84±3.50 vs 38.38±4.25,P<0.01)(图2B),凋亡细胞百分比显著增加(7.99±0.24 vs 1.81±0.12,P<0.001)(图2C)。这些结果均表明,丁酸梭菌显著抑制了肠肿瘤细胞的增殖并刺激了其凋亡。

图2 丁酸梭菌抑制肠道肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡

 

3、丁酸梭菌抑制Wnt /β-catenin信号通路

Wnt /β-catenin信号转导通路通常被认为是潜在的治疗靶标。与HFD-PBS小鼠相比,丁酸梭菌处理的小鼠的β-catenin表达偏低(28.98±1.55 vs 63.12±6.04,P<0.05),Cyclin D1的比例降低(27.73± 1.79 vs 42.80±5.58,P<0.05)(图3A、3B)。Western Blot结果显示,与对照相比,丁酸梭菌处理的HCT116细胞中β-catenin,Cyclin D1和C-Myc的表达均降低(P<0.001)(图3C和3D)。因此,Wnt /β-catenin信号的下调可能是丁酸梭菌抗癌作用的关键机制。

图3 丁酸梭菌抑制Wnt /β-catenin信号通路

 

4、丁酸梭菌改善了HFD诱导的肠道菌群失调

16S测序分析结果显示,HFD-CB组有294个OTU,HFD-PBS组有332个OTU,BD-PBS组有380个OTU,三组样本有222个共有OTU (图4A)。所有样本的肠道菌群中,Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Verrucomicrobia四个门的丰度最高。与对照组相比,HFD的小鼠中观察到低丰度的Bacteroidetes和高丰度的Firmicutes(图4B),因此,HFD的组中的Firmicutes / Bacteroidetes(F / B)比值增加。属水平上,HFD增加了致病菌的相对丰度,而丁酸梭菌处理则抑制了致病菌的增加(图4C)。

 

图4 丁酸梭菌调节Apcmin/+小鼠肠道菌群

 

另外,HFD的处理导致了样本Shannon和Simpson指数的显著降低(Shannon:5.05±0.22 vs 5.52±0.34,P<0.05; Simpson:0.94±0.01 vs 0.95±0.01,P<0.05)(图4D、 4E),而丁酸梭菌对这两个指数的影响并不显著,表明HFD对肠道菌群的α多样性产生了更大的负面影响。ANOSIM分析表明,三组样本的肠道菌群结构差异较大(R=0.63,P=0.001)(图5A)。PCoA分析表明,HFD-CB和HFD-PBS两组的肠道菌群结构更为相似(图5B)。LEfSe分析确定了在丁酸梭菌处理组中显著富集的物种(图5C)。这些结果均表明,HFD引起了肠道菌群组成的改变,而丁酸梭菌改善了由HFD引起的肠道菌群失调。

图5 丁酸梭菌改变特定细菌类群

 

5、丁酸梭菌改变了微生物衍生代谢产物的水平

通过代谢组学的检测,发现HFD引起胆酸(CA)浓度略微增加,但鹅去氧胆酸(CDCA)的水平基本没有差异,初级胆汁酸(BAs)水平并未受丁酸梭菌处理的影响。与对照组相比,HFD组样本次级胆汁酸脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)的水平显著增加(DCA:0.63±0.16 vs 0.17±0.03 mg/g,P<0.001; LCA:0.14±0.02 vs 0.10±0.02 mg/g,P<0.01),而丁酸梭菌组DCA和LCA水平显著降低(DCA:0.46±0.04 vs 0.63±0.16 mg/g,P<0.05; LCA:0.10±0.01 vs 0.14±0.02 mg/g,P<0.01)(图6A)。另外,与对照组相比,HFD组的短链脂肪酸(SCFAs)浓度有所升高。而丁酸梭菌处理组的乙酸、丙酸、丁酸浓度均显著高于HFD组(图6B)。这些结果表明,丁酸梭菌的抗癌机制可能部分归因于微生物衍生代谢产物的改变。

图6 丁酸梭菌改变了微生物衍生代谢产物的水平

 

6、丁酸梭菌激活G蛋白偶联受体

短链脂肪酸通过与GPR(GPR41;GPR43;GPR109A)结合而诱导多种信号传导途径,抑制肠道炎症。与对照组相比,丁酸梭菌上清液和丁酸钠刺激HCT116细胞,引起GPR43 mRNA水平上调4.5倍和4.2倍,GPR109A mRNA水平上调2.6倍和7.0倍(图7A)。另外,细胞周期进程的重要抑制剂P21WAF1在丁酸梭菌处理的HCT116细胞中升高, GPR43的沉默阻断了丁酸梭菌介导的P21WAF1表达(图7C)。与BD-PBS组相比,HFD-PBS组中GPR mRNA水平没有明显变化;与HFD-PBS组相比, HFD-CB组中GPR43和GPR109A的mRNA水平分别上调了3.89倍和3.8倍(P<0.05)(图7D)。GPR43和GPR109A的表达从人正常结肠组织到腺瘤再到肠癌逐渐减少:与腺瘤组织相比,癌组织中GPR43和GPR109A阳性细胞的百分比显著降低(GPR43:13.84±2.86%vs 27.50±3.75%,P<0.05;GPR109A:19.46±3.22%vs 30.70±3.74%,P<0.05)(图7E)。这些结果表明,GPR43和GPR109A受体激活在丁酸梭菌的抗癌机制中起着关键作用。

图7 丁酸梭菌激活G蛋白偶联受体和P21WAF1表达

 

研究结论

1、结直肠癌小鼠模型(Apcmin/+小鼠)中,丁酸梭菌能够抑制肠道肿瘤的发展,表现在其能够抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。

2、丁酸梭菌能够抑制Wnt /β-catenin信号转导通路,可能是其抗癌作用的关键机制。

3、HFD引起肠道菌群组成的改变,而丁酸梭菌能够改善由HFD引起的肠道菌群失调。

4、丁酸梭菌改变了微生物衍生代谢产物的水平,其抗癌机制可能部分归因于此。

5、丁酸梭菌可作用于G蛋白偶联受体,通过激活GPR43发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。

 

亮点

本研究揭示了丁酸梭菌在结直肠癌发展中的重要作用,丁酸梭菌可通过抑制Wnt /β-catenin信号转导通路、调节肠道菌群组成、改变菌群代谢产物、作用于GPR43受体等方式,抑制肠道肿瘤形成,为今后结直肠癌的治疗提供了新的思路。

下一篇

版权所有 上海锐翌生物科技有限公司 沪ICP备16022951号