2019-12-18浏览量:257

宏基因组技术识别人工关节感染病原体

导读

人工关节感染(PJI)是一种毁灭性的并发症,占总关节置换术的2%。多种病原体感染都会引起PJI,包括需氧菌、厌氧菌以及真菌,混合微生物感染也很常见。尽管培养技术和基于PCR的分子生物学测定法有所进步,但仍有相当多的病例无法确定病原微生物。在这种情况下,医生通常凭经验给予广谱静脉抗菌药物治疗方案,进而导致病原微生物对抗生素产生抗性。

 

近几年越来越多的研究人员证实了宏基因组鸟枪法在包括感染性疾病在内的临床疾病中的应用。该研究从切除的假体中收集了408份超声处理液样品,进行宏基因组测序分析。这是迄今为止所有类型临床标本进行宏基因组分析的最大研究队列。此外,与其他小样本量研究相比,该研究使用不同的样本处理方法,尤其是不同的微生物DNA富集方法和测序技术,从而可以更深地覆盖被检微生物。

 

 

文献ID

原文标题:Identification of Prosthetic Joint Infection Pathogens Using a shotgun Metagenomics Approach

译名:利用宏基因组技术识别人工关节感染病原体

杂志:Clinical Infectious Diseases  IF: 9.055

发表时间:2018年

通讯作者:Robin Patel

通讯单位:美国梅约诊所医学部传染病科

 

 

材料与方法

利用切除的人工髋关节和膝关节成分制备超声处理液,排除从抗生素垫片和聚乙烯插入物中得到的超声液。从使用基于超声处理的培养方法评估的切除关节成形术数据库中一次选择408个样本,包括培养阳性PJI,阴性培养PJI和无病原体感染样本。其中20个样本由于含有高水平污染性DNA而被排除分析。

 

根据美国传染病学会(IDSA)对PJI的诊断标准,将样品分为无菌性失败或PJI两类。每10ml含20个以上菌落形成单位(CFU)的超声液被认为是培养阳性。

 

 

研究成果

经过IDSA诊断,共有213个PJI样本和195个无菌性失败样本。受试者统计学资料、分类标准和临床相关发现(包括实验室检测)数据见表1。通过宏基因组测序,每个样本平均产生28592988对reads。

 

表1 受试者的特征

 

无病原体感染样本分析

为测定人工关节中是否存在微生物, 对195个未感染的假体产生的超声处理液进行宏基因组测序分析。在这些样本中,有7个(占3.6%)包含足够的数据和参考基因组覆盖度,表明可能存在细菌(表2和表3 )。已知所有检测的物种都能引起PJI(表4)。7例中有6例是同时使用两种分析工具检测到的,1例是单独使用Livermore宏基因组分析工具检测到的。另外,很多未受感染的样本中均存在大量的微生物reads,说明宏基因组测序过程中存在污染物DNA序列,特别是在剔除人类DNA后的低质量DNA样本中。这些序列与参考基因组的比对总是导致短基因组片段的高覆盖深度,而不是分布在整个基因组中,这种模式通常出现在只有试剂而没有输入样品的阴性对照中。

 

宏基因组测序与超声液培养结果比较

在对可能受感染的关节形成术进行临床评估时,通常会有多种来源的多种培养物,包括滑膜液、术中组织标本和超声处理液,最后一种培养物是在去除假体后试图将附着在假体表面的细菌驱逐出去。超声处理液是该研究中唯一经宏基因组测序的样本,因此直接将测序分析结果与超声处理液的培养结果进行比较。

 

在213例PJI患者的超声液体标本中,培养阳性115例(54%),培养阴性98例(46%)(表2)。通过宏基因组学技术在99例(86.1%)患者中发现了与培养相同的结果,在11例(9.6%)患者中发现了其他潜在的病原体。这11例中有4例是已知的混菌感染,其中发现了其他可能的病原体。另外7例经培养显示为单菌感染,但发现至少有1个新的潜在致病菌。在1例(样本588)样本中,两种宏基因组分析工具鉴定的物种(Peptoniphilus harei)与传统技术检测的不同,包括16S rRNA基因测序和快速吲哚试验(Peptoniphilus indolicus)。

 

在6例样本中,传统培养方法检测出的病原物并未从宏基因组技术中测出,其中2例未检测出的病原物是Pseudomonas aeruginosa。之后的测试结果揭示某些P.aeruginosa菌株在实验过程中经过MolYsis处理可能更易发生DNA降解。

 

在98例被认定为培养阴性超声处理液样本中,有43例通过宏基因组技术发现潜在致病物。被识别的微生物主要包含先前报告的PJI致病物(表4)。

 

表2 宏基因组测序与超声处理液培养结果比较

 

宏基因组测序结果与所有来源的培养结果比较

为了更好地反映临床情况下所有可用的数据,将宏基因组结果与所有可用的培养结果进行比较,包括术中组织和术前任何时间培养的滑膜液。除此之外,还有31例PJI病例被归类为培养阳性(表3)。在146例(82.9%)培养阳性病例中,有121例具有相同的致病物,另外12例中发现了其他的潜在病原体。然而,16例(11.0%)中至少有1种已知病原体未被宏基因组技术检测到。在这些病例中,有14例在摘除假体之前使用了抗生素。宏基因组仍能在67例(31.3%)培养阴性样本的21例中发现新的潜在致病物。

 

表3 宏基因组测序和所有培养(术中组织、术前滑膜液、超声处理液)结果的比较

 

表4 来自不和谐样本中的物种

 

检测到的微生物的reads数量

样本中主要病原体或潜在病原体的read数量被计算用以评估基因组覆盖深度,这对于基因功能分析十分重要,如抗生素耐药性预测。在培养检测到的110种病原菌中,已知病原菌的双端reads的平均数为4989251,每种病原菌的reads中位值为1978090,最大值为32892968,最小值为117(表5)。未培养的潜在病原体的测序read数量更少,无病原体感染样本的平均read数量为113969,培养阳性PJI样本中平均read数量为1948403。

 

表5 宏基因组技术在属水平识别出的样本中已知或潜在病原物的read数量

 

研究结论

1、宏基因组鸟枪测序有可能提高或改变难以检测的病原体的数量。

2、如何排除背景菌和试剂污染菌是宏基因组技术面临的重大挑战。

3、参考数据库的局限性也会导致一些微生物无法通过宏基因组学方法检测到。

4、细菌或其他微生物作为无菌性松动或无病原体感染的其他原因的贡献者的作用仍然是一个活跃的研究领域。

5、DNA富集技术有待进一步提高。

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