2019-12-13浏览量:838

Nature:人胎盘没有微生物群,但可能含有潜在的病原体

导读

胎盘功能障碍与常见的不良妊娠结局相关,然而胎盘功能障碍的原因在大多数情况下是未知的。已有几项基于宏基因组测序、16S rRNA基因扩增子测序的研究表明:胎盘被多种细菌定植(胎盘微生物),并且良好妊娠人群与不良妊娠人群间的胎盘微生物存在差异。这与测序时代前认为胎盘正常情况下是无菌的观点形成了对比。然而,另外几项应用测序方法的研究却未检测到胎盘微生物群,这表明有可能存在污染导致假阳性结果的情况。

 

基于此,英国剑桥大学妇产学系的D. Stephen charnock-Jones 和Gordon c. S. Smith教授团队进行了子痫前期、自然早产(PTB)或小于胎龄婴儿(SGA)的分娩是否与胎盘中存在细菌DNA相关的研究,并进一步确定胎盘中是否存在微生物。无论是复杂妊娠还是非复杂妊娠,该研究结果显示大多数的胎盘样本中并不存在细菌。胎盘中检测到的细菌几乎都是在分娩过程中获得的或者与实验室试剂中细菌DNA的污染有关。唯一的例外是无乳链球菌(B组链球菌),在临产前采集的样本中,约5%的样本检测到了该菌,而无乳链球菌是新生儿败血症的主要原因。以上结果表明人胎盘没有微生物群,但可能含有潜在的病原体。

 

 

文献ID

英文题目:Human placenta has no microbiome but can contain potential pathogens

中文题目:人胎盘没有微生物群,但可能含有潜在的病原体

发表期刊:Nature   IF:43.07

见刊时间:2019.07.31  

发表单位:英国剑桥大学妇产学系

 

 

材料与方法

该研究使用多种DNA提取和检测方法,研究了537名妇女的胎盘活检,其中包括318例不良妊娠结局和219例对照组。该研究分为两个队列:在队列1中,婴儿均为产前剖宫产,包括20例子痫前期孕妇、20例分娩小于胎龄(SGA)婴儿的孕妇和40例对照组的胎盘样本。胎盘活检中约有1100个bongori沙门氏菌-邦戈尔沙门氏菌-的集落形成单位(CFUs)(阳性对照),使用深度宏基因组测序(平均每个样本有4.24亿个读数)和16S rRNA基因扩增子测序对样本进行分析,比较2种方法的检测结果。队列2包括100例子痫前期孕妇、100例分娩SGA婴儿的孕妇、198例匹配对照组(2例对照2次)和100例早产孕妇的胎盘样本。所有这些样本都使用两种不同试剂盒提取的DNA进行了两次16S rRNA基因扩增子测序分析,比较不同提取方法对结果的影响。

 

2个队列胎盘样本分析流程

 

 

研究成果

1、队列1:宏基因组和16S rRNA基因扩增子测序比较

阳性对照(S. bongori,平均每个样本180条reads)在所有样本中均被检测到,还观察到其他几种细菌信号。主成分分析(PCA)显示(图1a),宏基因组学数据中几乎所有的变化(98%)都由主成分1(80%)和2(18%)导致,而这一变化是由批次效应而非疾病-对照组所导致的(图1b)。任何与加工批次有关的变化,而不是分组相关的,均是由于污染造成的。热图显示(图1c),10个批次中有8次检测到明显的大肠杆菌信号(64个样本中有超过20,000条Reads,16个样本中有50–150条Reads)、大量其他一些细菌信号以及高水平的PhiX174的Reads数(第一组;图1 c)。根据最近的参考基因组(WG5),对所有样本的所有大肠杆菌序列进行附加分析,发现所有大肠杆菌序列属于同一品系,因此是由于污染造成的。Run 4和Run 5的所有样本(图1b)也有较强的慢生根瘤菌和沼泽红假单胞菌信号 (PCA分析的第二组)。Run 8和Run 9(第三组)则没有检测到这些信号。2个样本具有很强的人疱疹病毒6B (HHV-6B)信号(图1a-c),它反映了染色体整合病毒的遗传,在西方种群中影响0.5-1%的个体。

 

图1 a-c. 队列1样本宏基因组和16S rRNA基因扩增子测序数据

 

该研究还分析了来自队列1的79个样本的宏基因组测序和16S rRNA基因扩增子测序的一致性(表1)。两种方法唯一一致检测到的信号是S. bongori。16S rRNA扩增子测序平均发现约33,000个S. bongori reads(占总reads的54%)。16S阴性对照(表1)没有检测到S. bongori。使用kappa统计量评估宏基因组学和16S rRNA对其他细菌信号的一致性水平,发现只有两种信号显示了两种方法之间的一致性:无乳链球菌(S. agalactiae)和地热球菌(Deinococcus geothermalis)(表1)。由于阳性样本的数量太少,无法对病例和对照组进行有益的比较。

 

表1 比较宏基因组测序与16S rRNA基因扩增子测序检测到的主要信号

 

主成分2相关的几个细菌信号,包括CaulobacterMethylobacteriumBurkholderia genera,也被16S rRNA基因测序检测到。然而,kappa统计值较低,阴性对照组也检测到这些信号(表1)。使用宏基因组测序分别检测到了14例霍乱弧菌和11例肺炎链球菌信号。然而,使用16S rRNA基因测序却没有发现(表1)。对这些序列进行装配和分析,发现这些信号是由于文库制备或测序期间的交叉污染造成的(相同的解释适用于婴儿利什曼虫,图1c)。

 

2、队列2:基于不同DNA提取试剂盒的16S rRNA测序比较

比较两种DNA提取试剂盒(MP Biomedical kit,以下简称Mpbio,或Qiagen kit)的16S rRNA基因测序结果,发现仍然具有批次效应。在一些批次中,慢生根瘤菌(Bradyrhizobobium)几乎无所不在,且丰度较高,但在其他批次中较少被检测到,且丰度较低(图1d,将批次K和L与批次I和J进行比较)。而伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia),一种之前被认为与早产相关的细菌,在使用Mpbio试剂盒分离出的样品中比使用Qiagen试剂盒分离出的样品具有更高的信号,并且也表现出明显的批次差异(图1e)。此外,在阴性对照中也常检测到慢生根瘤菌和伯克霍尔德菌。除了提取试剂盒,不同的聚合酶链式反应(PCR)试剂也存在批次效应,例如,图1f显示了Thiohalocapsa halophila与PCR试剂5 Q5 buffer (lot 11408)或Q5 Taq聚合酶(lot 51405)之间的联系。而从生态学角度出发,可信度较高的物种如无乳链球菌(S. agalactiae)和李斯特菌(Listeria monocytogenes),阴道乳酸杆菌,阴道病相关细菌,粪便相关细菌和一些可能的口腔细菌的检测结果均具有相对较高一致性,表明它们是来源于样品而非污染,但是不同的DNA提取方法也会影响它们的信号强度。

 

图1 d-g. 队列2样本基于不同DNA提取试剂盒的16S rRNA基因扩增子测序比较

 

3、分娩相关信号

在队列2的检测结果中,阴道微生物(乳酸菌和阴道相关细菌)比无乳链球菌(S. agalactiae)更丰富,但在队列1(仅产前剖腹产)中,阴道微生物比无乳链球菌(S. agalactiae)更少。因此,作者接下来研究了传递方式和16S rRNA信号之间的关系。阴道乳酸杆菌(Lactobacillus inersLactobacillus crispatusLactobacillus gasseriLactobacillus jensenii)在经阴道分娩的胎盘中比经产时或产前剖腹产分娩的胎盘更常见,数量也更多(图2b),并且该结果与DNA分离方法无关。阴道相关细菌在阴道和产时剖宫产样本中发现的频率大致相同,但在产前剖腹产样本中,这一比例明显降低(图2c)。

 

图2 16S rRNA基因扩增子测序分析阴道细菌与分娩方式的相关性

 

4、真实的信号和妊娠结果

根据临床结果(SGA、子痫前期、PTB)分析了无乳链球菌的存在,因为它是唯一满足所有标准的真正与胎盘相关的细菌信号(表2)。结果显示该菌与SGA、子痫前期、PTB无相关性(图3)。探索性分析16S扩增子测序数据的所有样本相关信号,包括分娩相关的细菌,表明S. mitisF. nucleatum与不良妊娠结局无关。然而,值得注意的是,与分娩相关的L. iners菌与子痫前期、Streptococcus anginosusUreaplasma属与PTB具有显著相关性。此外,在一个早产胎盘样品中,发现了较强的L. monocytogenes菌信号。

 

图3 细菌信号和不良妊娠结局

 

5、 验证无乳链球菌(S. agalactiae)的存在

采用巢式PCR和定量PCR (qPCR)方法,以编码无乳链球菌表面免疫原性蛋白的sip基因为靶标,在276个胎盘样本中验证了其存在,并获得了16S测序结果。通过qPCR检测,276份样本中有7份为阳性,通过16S检测,7份样本均为阳性(超过1%)。255份样本经两种方法检测均为阴性,14个样本PCR结果显示阴性,16S rRNA基因测序结果为阳性,kappa检验结果显示0.48的一致性。16S rRNA扩增对无乳链球菌的检测是通过另外两种独立的方法(宏基因组学和qPCR)进行验证的,两种方法的一致性都较高。造成不一致的原因可能是由于无乳链球菌基因组有6个拷贝的16S rRNA基因,但是只有一个拷贝的SIP蛋白基因,所以相比PCR,16S rRNA扩增对该细菌的敏感性可能更高。

 

 

研究结论

该研究使用多种DNA提取和检测方法,研究了537名妇女的胎盘活检,其中包括318例不良妊娠结局和219例对照组,得出了几个重要结论。首先,发现从人胎盘提取的DNA中细菌序列的生物量非常小。其次,发现胎盘样本中细菌DNA的主要来源是实验室试剂和设备的污染。第三,宏基因组学和16S扩增子测序都能够检测到非常低数量的污染信号。第四,胎盘组织样本在生产和分娩过程中会受到污染,即使是从胎盘中分离出来的。最后,唯一有强有力证据证明在分娩前存在于胎盘的生物是无乳链球菌,不受批次效应的影响,3种方法(16S测序、宏基因组测序、qPCR)均可检测到并具有很高的一致性。然而,该菌的存在与子痫前期、SGA或PTB之间没有显著的相关性。对其他信号的探索性分析证实了PTB与Ureaplasma属的存在具有相关性,这与以前的研究一致,但这可能是上行子宫感染的结果。最终的结论是,细菌性胎盘感染不是导致人类妊娠胎盘相关并发症的主要原因,而且人类胎盘没有常驻微生物群。

 

此外,分娩前在胎盘中发现无乳链球菌具有相当重要的临床意义。无乳链球菌的母婴传播可导致婴儿致命的败血症。据估计,在美国对所有孕妇进行无乳链球菌的常规筛查和有针对性地使用抗生素,每年可防止200例新生儿死亡。该发现为围产期筛查无乳链球菌提供了一条新的途径,但还需要进一步的研究来确定胎盘中该菌的存在与胎儿或新生儿疾病之间的关系。如果这种联系被确定,快速检测胎盘是否存在无乳链球菌可能使新生儿调查和治疗成为可能。该结果也阐明了该菌在胎儿定殖的可能途径。虽然该研究没有发现胎盘微生物群的证据,但在剖宫产后,胎盘阴道细菌的检测频率增加了,提示阴道细菌上升或血行播散。类似地,短暂菌血症引起的血行播散可以解释少量与样本相关的口腔细菌信号的存在,这种扩散可能造成胎儿在分娩前立即定植微生物群。

 

更重要的是,该研究确定了五种不同的污染模式(图4):1. 在分娩过程中,胎盘被真实的细菌污染(图2,如Lactobacillus);2. PBS冲洗活检时的污染(如D. geothermalis);3. 提取过程中DNA的污染(如B.silvatlantica);4. 测序前用于扩增DNA的试剂污染(如T. halophila);5. 来自用于测序的试剂或设备的污染(如V. cholerae)。

 

图4 在人类胎盘样本中检测到的细菌信号来源

 

 

亮点

该研究发现大多数的胎盘样本中并不存在微生物群,除了在大约5%的妇女临产前的胎盘中发现了一种重要的病原体——无乳链球菌,该菌可引起新生儿败血症,此发现对新生儿败血症的预防具有重要意义。同时,更重要的是,该研究证实了胎盘微生物检测过程中存在的污染模式,为其他微生物组实验的采样、处理、测序过程提供了指导,以帮助研究者们更加关注污染问题及批次效应,最终获得更加严谨、真实、正确的科学结论。

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