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综述:宏基因组学和临床微生物学

导读

随着二代测序方法的出现,宏基因组学的研究变得越来越广泛。在这篇综述中,我们将讨论宏基因组学在细菌病原体检测中的应用,并阐述宏基因组结果的解释可能会随着分析样本的类型而波动。我们提出了宏基因组学在抗菌素耐药性评估、流行病学调查和法医学中的应用观点。其次,我们介绍了NGS检测的结果分析及其在常规临床微生物学中的应用,仍然需要更多研究支持。


原文献ID

题目:Metagenomic and clinical microbiology

期刊:Human Microbiome Journal

发表时间:2018年6月

通讯作者:Jean-Christophe Lagier

 

1. 引言

自20世纪末以来,随着组学技术的出现,临床微生物学发生了巨大的变化。分子工具的增加使得无需任何培养步骤即可快速诊断,并改变了检测某些感染(如由沙眼衣原体引起的感染性疾病)的方式。同时,由于MALDI-TOF质谱法及其在临床微生物学中的应用,促进了微生物培养的鉴定。目前,微生物抗生素敏感性检测仍然是诊断过程中最繁杂的部分。经典的临床微生物学方法依赖于科赫原理,强调了微生物纯培养对证明其致病性的重要性。然而,随着分子工具和宏基因组分析的出现,传统培养法有时似乎被丢弃了。

 

宏基因组的原理依赖于来自包含一种以上微生物的复杂环境中样品的基因组分析,从而提供了该样品组成的视图。随着新一代测序(NGS)的出现,宏基因组研究变得越来越容易。

 

在这篇综述中,我们提议探索宏基因组学在临床微生物学中的应用现状,重点关注这些方法的风险和它们面临的困难。

 

2. 宏基因组学在临床微生物学中的应用现状

2.1 病原体检测

宏基因组学已多次被用于临床样本中病原体的检测。我们将描述它在细菌微生物学中的应用。大多数研究报告了与传统培养方法相比对宏基因组学的评估,在某些情况下,例如无法通过培养或标准分子工具进行诊断的时候,宏基因组学分析可以做出诊断(表1)。

 

表1 应用宏基因检测来诊断的文献


 
Wilson等人首次报道了一例采用宏基因组学解决的脑炎病例。尽管进行了广泛的探索,包括对脑脊液进行16S rRNA扩增和测序,但仍未发现病因。最后Wilson用宏基因组学方法在脑脊液中检测到钩端螺旋体,而在对照样本中未检测到。之后特异性分子工具和血清学检测进一步证实了该诊断。

Fukui等人报道了一例培养阴性的心内膜炎(血液培养和瓣膜培养均为阴性,但未对血液或心脏瓣膜进行16S PCR检测),但是宏基因组检测到软弱克养菌(Abiotrophia defectiva的存在。在其他三项研究中(表1),宏基因组学检测到以前研究中未发现的病原体,并实际影响了治疗方案。在所有这些病例中,被研究的样本被假定为无菌的。其他作者使用宏基因组学作为诊断工具,对未解决的病例进行回顾性评估(表1)。

 

Thoendel等人使用宏基因组学分析了来自关节成形术的超声液体样本,并检测了从未在骨和关节感染中检测到的唾液支原体。尽管如此,本病例中的患者在全膝关节置换术(TKA)后,接受了6周头孢吡肟和万古霉素的经验性抗生素治疗,且术后恢复良好。但是这两种抗生素对支原体无效,只有在隔离液中加入庆大霉素才能对检测到的微生物进行处理。事实上,在这种感染中,唾液支原体的致病关联仍然值得怀疑。

 

其他研究报道了宏基因组检测与传统方法相比在病原体筛选方面的效率。Hasman等人对疑似尿感染患者的尿液样本进行了培养和宏基因组分析,发现两种方法具有良好的一致性。然而,宏基因组分析往往发现不止一个的病原体,且未分析各个病原体的致病因素。此外,作者没有提到在测序过程中使用过对照样本。

 

Hilton等人使用培养和宏基因组学(16S和Shotgun)分析呼吸机相关性肺炎患者的临床样本。宏基因组学正确地识别了致病原,但每个样本的结果都是多种菌的存在,致病原并不总是被广泛检测到的那个。

 

Zhou等人评估了16S或Shotgun宏基因组与PCR检测艰难梭状芽胞杆菌的一致性。他们在90%的样本中检测到了这种细菌。Kirstahler等人将宏基因组和两种DNA提取方法与标准的细菌培养方法进行比较,用于诊断脑膜内炎。12份培养阳性的玻璃体标本中,9例(75%)与宏基因检测结果一致。最有趣的是,作者用生理盐水、未感染的玻璃体标本和空白DNA提取液作为对照;他们检测出并强调了经常出现的环境污染微生物。

 

所有这些研究都是在假定样本存在感染的情况下进行的。事实上,在没有临床症状的对照样本中可以发现致病菌。所有的分析解释困难都来自于从该方法检测到的多个病原体中选择一个真正导致患者致病的病原体。

 

另一方面,宏基因检测也已用于标准培养结果之前的快速诊断。在获得标准培养结果之前的17小时,通过离子技术测序在支气管肺泡灌洗液中检测到了铜绿假单胞菌。在感染菌株的MALDI-TOF质谱结果完成之前,在脓毒症患者的血液中检测到了犬咬二氧化碳嗜纤维菌Capnocytophaga canimorsus)。

 

总之,NGS检测可以在非特异性症状前成为临床诊断工具,但其结果解释因样本类型而异。与来自已知未消毒样本(如痰液样本)的多菌结果相比,在脑脊液样本中检测到的单个细菌最容易解释。在本部分引用的15项研究中,有11项是由于宏基因组学而提出的诊断,但只有8项以前瞻性的方式使用了宏基因组学作为诊断工具。此外,这些研究中只有两项[6,17]使用宏基因组学作为唯一的诊断工具(没有其他分子工具可以证实结果)。

 

2.2 耐药基因组评估

由于构成肠道菌群的细菌大部分是不可培养的细菌,因此利用NGS来检测抗生素抗性基因(ARG)是一件很有趣的事情。

 

在一项针对肠道菌群的宏基因组研究中,重点研究了三组(高风险住院患者、低风险门诊患者和对照)中耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的肠球菌和多重耐药(MDR)肠杆菌的检测。结果表明,与对照组相比,患者的ARGs明显更高,而且他们证明了宏基因组学可以检测到被培养忽略的ARGs。

 

Gyarmati等人使用宏基因检测分析了中性粒细胞减少症患者在感染不同阶段的血液。患者中性粒细胞减少症较多;在血流中检测到更多的微生物。然而,他们确实强调了2例患者对四环素的耐药性和3例患者对大环内酯的耐药性。Zhou等人在他们的研究中,一半的样本识别出27个ARGs。25.9%的样品含有针对头孢菌素的ARGs, 25.9%的样品含有针对四环素的ARGs。在一个临床尿液样本和健康尿液样本加入MDR肠杆菌的模型中,Schmidt等人使用宏基因检测到了92%通过直接测序菌株检测到的ARGs。因此宏基因检测的前景十分有趣,可以同时检测样本中的病原体和分析其ARG。

 

2.3 流行病调查

在对志贺产毒素大肠杆菌O104:H4爆发的调查中,作者回顾性分析了40个培养阳性样本。使用宏基因检测,他们重新组装了病原体的基因,并在67%的样本中检测到这一序列。尽管测序深度较高,尚未在所有基因中检测到决定基因。

 

Huang等人调查了两次同时发生的由肠道沙门氏菌引起的食源性疾病暴发。利用NGS测序,他们证明了这两次暴发是相互独立、由不同的分离株引起的。他们还发现了一种可能的细菌感染。

 

2.4 法医学

宏基因组学在临床微生物学中的另一种应用是它在法医学上的应用。微生物群可用作个人身份证。例如,唾液微生物群可以用来区分两个个体。不同的微生物群针对身体的不同部位或不同种类的液体。在接触过的物体上,被检测出的细菌比人类DNA多得多,而宏基因组分析可以帮助识别或排除刑事案件中的嫌疑人,或识别样本的性质。

 

3. 目前在临床微生物学中对宏基因检测数据的结果分析受到限制

在最近的一项研究中,Abayasekara等人对各种临床样本进行了宏基因组敏感性(52.7%)和特异性(91.8%)的病原体检测。这种低敏感性突出了对宏基因组结果进行非常谨慎的解释的必要性。在这一部分中,我们将描述在NGS检测过程中,每一步可能干扰到结果分析的限制和偏差。

 

3.1 样品采集和制备

在临床微生物学中,样品的收集和制备有一定的制度和标准。从患者收集样本到对其进行分析之间的时间可能会导致DNA降解并导致结果分析的错误。有研究对婴儿的粪便样本进行了分析,其样本在室温保存两个小时以上会导致某些微生物菌群的相对丰度发生变化,包括链球菌的相对丰度增加到5.2倍。作者注意到,室温1小时后相对丰度增加两倍以上的菌属中,有75%的植物具有耐空气性,并且他们认为氧气暴露是需要考虑的重要因素。

 

另一个难题是提取的DNA数量,这取决于所测试的样品:获得宏基因组测序所需的最低DNA量。在他们的研究中,Ruppé 等人在他们的研究中计划对179个来自骨骼和关节感染的样本进行测序,但是由于提取的DNA比例太低,他们只能对他们的部分样本(13.4%,24/179)进行测序。

 

3.2 提取偏差

DNA提取方法对结果的影响已经得到了很好的描述。事实上,最终的结果可能与预期的样品组成非常不同,例如焦磷酸测序未能检测到革兰氏阴性细菌。通过对人类微生物组项目中使用的两种DNA提取方法的比较分析,证明该方法对结果的影响在门水平上存在差异。Brooks等人用80个模拟细菌的模型证明了DNA提取试剂盒对结果的影响,证明提取和扩增是宏基因组分析中产生最大偏差的两个步骤。Angelakis等人在同一粪便样本上测试了10种DNA提取方法,他们得到了不同实验方案之间一致的物种多样性(Shannon指数从1.37到4.4)和丰富度(Chao指数从227到2714)的变化。

 

3.3 样本中的人类DNA和环境微生物

人类DNA代表了绝大多数临床样本,可以解释99%的解读。在细菌丰度较低的样品中可以发现微生物的DNA富集。在两个富集试剂盒的比较研究中,Thoendel等人能够用富集因子从13扩增到9580。另一方面,人类的DNA也可以通过测序来分析宿主的反应。在16S分析中,所需要的细菌可以在扩增和测序之前用探针直接靶向。提出了痰中结核分枝杆菌的检测方法。

 

环境污染物可能会影响分析结果,特别是在生物载量较低的样本中。然而,污染物可以在硅中产生。阴性对照可以与样品平行排列,以便检测这些污染物。对照样品可以用DNA或整个微生物进行标定。“刷卡测试”与拭子的实验室环境可以还建议检测这种污染物。

 

3.4 深度偏差

宏基因组学只能分辨浓度大于每克粪便10^6的细菌。由于每个样本中含有大量的人类DNA,因此需要在宏基因检测中有非常高的测序深度才能对预期的病原体进行测序。然而,一些肠道病原体在浓度非常低的情况下具有侵袭性,如伤寒沙门氏菌和志贺氏菌,这些病原体在宏基因组分析中可能被忽略。为了克服此限制,可以使用病原体DNA富集和人类DNA去除的方案。也可以使用掺有恒定浓度细菌进行对照。

 

3.5 生物信息流程和标准化

一旦获得测序,原始数据必须转化为按相对丰度排序的细菌分类列表。在这一过程中,必须遵守各种步骤:必须从NGS中去除序列适配器,必须去除人类DNA序列,必须将reads组装到contigs中,每个序列必须与数据库交叉引用。必须根据分析所需的速度和准确性来选择数据库和定义与属或种级别匹配的参数。不完整的参考数据库将是这一步分析的混杂因素。

 

目前,每个实验室都在构建自己的流程,没有独特的平台来执行所有这些步骤。在临床微生物学中,可用流程进行病原体筛选(如SURPI)。除了缺乏标准化之外,还存在一些限制,如将AMR基因的序列分配给被检测到的病原体或背景微生物群。所有的信息学工具都需要特定的专业知识,生物信息学家需要扎实的生物培训来指导他们根据提出的问题进行研究。此外,所产生的所有数据代表了大量的信息,必须预料到储存这些数据的规定。

 

3.6 结果解释

 一旦样品中的微生物成分可用,就必须确定每种细菌的作用。

 

首先,必须确定检测到的序列是否属于活性细菌。宏基因组学只检测DNA,无法知道被检测到的病原体是死的、静止的(例如在第一代抗生素之后)还是活的。元转录组学,即RNA扩增,可用于活性细菌检测。这是在不久的将来需要解决的关键问题。

 

对于多菌结果,必须对检测到的每个细菌的意义进行评估。Hilton等人在宏基因组检测和培养对肺炎诊断的比较研究中发现,相对丰度最高的病原体并不总是导致疾病的病原体。此外,NGS检测的结果总是显示多个微生物,没有线索可以明确哪个细菌是疾病的原因。Stammlet等人提出,通过向临床样品中添加受控量的细菌并确定读数所检测到的微生物载量来校准宏基因组学结果的方法。

 

最后,不应忽视未识别的操作分类单元(OTUs)。宏基因组研究检测到的大部分(80%)细菌对应于未培养的细菌或尚未培养的细菌。如果使用宏基因检测作为诊断工具,目前尚不清楚相对丰度最高的序列是否与未识别的OTU相对应。

 

4. 当前宏基因组学推广到临床微生物学的技术局限性

4.1 结果的时间和成本限制

随着技术的进步,采样到最终结果之间的时间越来越短。随着NGS的应用越来越广泛,它的成本对实验室来说也越来越可承受。研究实验室使用的大多数NGS技术在24-72小时内完成(不包括分析时间),第三代测序技术甚至可以在不到1小时内完成。一些作者,如Afshinnekoo等人,已经提出了具有指定截止日期的临床样本宏基因检测分析的方案。第一个跟踪过程称为STAT,它可以在24小时内对致病菌、抗菌素耐药性鉴定和毒力因子进行分析。另外两个轨道可以在测序前用RNA富集方法或靶向PCR扩增进行更深入的分析,并持续5到7天。在临床细菌学中,自从使用MALDI-TOF MS进行细菌鉴定后,采样和结果之间的时间间隔显著缩短。然而,执行抗生素图谱的时间尺度还不能缩短。由于宏基因组学可以检测ARGs,因此可以快速获得样品中微生物耐药性的信息。我们有理由期待,在几年内,NGS方法能够比传统的细菌学方法更快地进行诊断。

 

 

4.2 给医生的解释

在整个NGS过程的最后,检测结果可能对医生有用。因为开抗生素的最终决定是由医生做出的,他们需要知道已经使用的方法和结果的可靠性。特别是当最终的NGS结果是不确定的时候(例如关于病原体或污染物),医生和生物学家之间的深入讨论是非常需要的。有趣的是,与全球宏基因组学文献相比,应用于临床微生物学的宏基因组学仅占现有文献的一小部分(图1),说明截止至2017年12月30日,该应用仍局限于学术研究。

图1 每年发表宏基因组学和临床微生物宏基因组学的论文数(数据来自Pubmed 2017/12/30)

 

5. 结论

宏基因组学在临床微生物学中的应用逐年增多。尽管约有15项研究使用这种方法在临床样本中检测致病菌,但只有两例中NGS是唯一的诊断工具。宏基因组学在ARG检测中的应用似乎很有潜力趣,但尚未作为常规工具进行测试来改变抗生素治疗。其它应用,如流行病调查或法医学,仍是需更多研究支撑。

 

未来此项技术需完善更多耐药基因方面的研究,来推进其在临床的全面应用。

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