2019-08-23浏览量:221

关鸿志 | mNGS技术在诊断中枢神经系统感染中的应用

导读

在今年的6月10日,北京协和医院神经科关鸿志教授联合国内多家医院,在BioRxiv杂志上在线发表一篇多中心研究文章:Metagenomic Next-generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid for the Diagnosis of Central Nervous System Infections: A Multicentre Prospective Study。这篇文章的发表预示着国内mNGS技术在中枢神经系统感染的诊断进入了应用阶段。

 

背景 

传染性脑炎和脑膜炎是造成神经系统疾病的主要因素。在现有的临床治疗中,这些疾病通常是经验性治疗,很多情况下难以确定其致病原。临床上会利用传统诊断技术来检测致病原,可结果只有50-80%的患病者到够检测出致病原。因此,传统检测方法带来的不确定性,常常造成病人的治疗延误、不充分和不适当。

 

早在2013年,美国Charles Chiu教授首次应用病原宏基因组(mNGS)技术,诊断出14岁小男孩因钩端螺旋体感染致脑病,且挽救了他的生命。在这之后,这项技术引起了全球神经科医生的极大兴趣.。

 

mNGS是一种高通量测序技术,它可以同时对成千上万到数十亿个DNA或RNA片段进行独立测序。和传统检测方法相比,mNGS无需输入临床预测因子或其他实验室结果,即可识别病原体。又因脑脊液(CSF)在健康人群中通常是无菌状态,所以神经科医生认为,在诊断中枢神经系统(CNS)感染中,使用CSF样本非常契合这项新技术的应用。

 

在这样的临床和技术背景下,关教授和其研究团队进行了一项多中心前瞻性研究,综合评价脑脊液 mNGS技术在诊断中枢神经系统(CNS)感染方面的表现,并与传统微生物学方法进行比较。

 

 什么样的病人使用了这项技术?

在长达1年的研究时间里,关教授及其研究团队共纳入来自中国20家医院的276例脑炎或脑膜炎患者。他们先从287例患者中排除了11例系统性血管炎、自身免疫性脑炎、原发性中枢神经系统淋巴瘤等非感染性疾病的患者,剩下的276例为符合以下标准的成年患者(表1):

 

主要标准(必选): 

患者就诊时出现无明确病因导致的超过24小时的精神状态改变(意识水平降低或改变,或者人格改变),且/或全身性或部分性癫痫(但并非完全归因于先前的癫痫症或单纯的发烧性癫痫)。

 

次要标准(≥ 2条):

1. 症状出现前或出现后72小时内发热≥38℃

2. 新发局灶性神经系统发作

3. 脑脊液白细胞计数≥5/立方毫米

4. 影像学上脑实质异常,提示脑炎

5. 脑电图异常与脑炎症状一致,且不能明确此症状病因

 

表 1

 

这276例脑脊液标本均使用mNGS技术检测,以传统检测方法为金标准,根据相关指南和共识,将mNGS的结果分为真阳性、假阳性和假阴性。

 

什么样的标准提示mNGS结果是真阳性的?

 

为了减少脑脊液样本受污染的影响,团队将检测到的种特异性序列数(SSRN)标准化至20M,并采用以下标准来判定mNGS的结果为阳性:

 

1) 对于细胞外细菌、真菌(隐球菌除外)和寄生虫,如果检测到的SSRN≥30(RPM≥1.50),在阴性对照中未出现且该读数在细菌、真菌或寄生虫中排名前10位,或者在阴性对照中出现,检出序列数是阴性对照的10倍且在过去一个月内未多次出现(多次判断标准>25%),则样本结果为阳性;

 

2) 对于胞内细菌(不包括结核分枝杆菌和布鲁氏杆菌)和隐球菌,如果检测到的SSRN≥10(RPM≥0.50),在阴性对照中未出现且该读数在细菌、真菌中排名前10位,或者在阴性对照中出现,检出序列数是阴性对照的10倍且在过去一个月内未多次出现(多次判断标准为>25%)则样本结果为阳性; 

 

3) 对于病毒、布鲁氏杆菌和结核分枝杆菌,如果检测到的SSRN≥3(RPM≥0.15),则认为结果为阳性。

 

有了标准后,真实检测结果如何?

 

总共276位患者的检测结果中,其中mNGS检测到阳性结果122例(假阳性12例),传统检测方法检测到阳性结果126例,且其中114例是“致病原”(表2)。

 

因此mNGS检测出真阳性结果为101例,阳性率为36.60%。所有mNGS结果均在不到48小时内获得,并且其速度快于任何传统检测方法。

 

 表 2

 

在首次被mNGS诊断的患者中,16.3%的感染是由细菌引起的,15.2%是由病毒引起的,2.9%是由真菌引起的,2.2%是由寄生虫引起的(图A)。

 

图 A

 

mNGS真阳性的结果细节如下(图B):  

 

11种细菌,其中常见的是结核分枝杆菌(14例,13.9%)和单核细胞增生李斯特菌(8例,7.9%);

7种病毒(BK多瘤病毒不是致病病原体),其中常见的是水痘带状疱疹病毒VZV(17例,16.8%)和单纯疱疹病毒1型 HSV1(12例,11.9%);

2种真菌,其中两种都是隐球菌(8例,7.9%);

2种寄生虫,其中猪肉绦虫(5例,5.0%)是最常见的。

 

图 B

 

 如何理解假阳性、假阴性结果?

 

假阳性:12例(4.3%)患者出现假阳性,主要与细菌感染有关(n = 12;表2),包括大肠杆菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽糖杆菌和铜绿假单胞菌,也有过布鲁氏菌的假阳性。

 

根据先前提出的标准,病毒、真菌或寄生虫没有假阳性。虽然人类疱疹病毒4型(EBV)在大多数病例中不是致病病原体,但在部分患者的脑脊液中存在。此外,大部分脑脊液样本都有一些背景污染(表2),但这些结果不符合阳性结果的标准。

 

观察到的各种类型污染可分为两组:(1)通常与背景污染相关的微生物,不符合阳性结果的标准(表2)和(2)满足mNGS阳性标准的假阳性结果,但与患者的临床表现和特征不一致。

 

作者后来又提出,污染主要来自以下来源:

(1)实验室操作(细小病毒NIH CQV是硅柱状核酸提取试剂盒中的一种污染物);

(2)试剂(缓生根瘤菌、伯克霍尔德菌和拉尔斯顿菌是工业超纯水系统中常用的污染物);

(3)环境(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌和扭矩病毒是医院环境中广泛存在的病原体);

(4)皮肤或其他身体菌群(痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌与人类皮肤菌群相关)。

 

假阳性结果很可能误导治疗,因此,临床医生应意识到这些在医院环境中普遍存在的细菌或真菌,在对待此类阳性mNGS结果时应该谨慎,特别是在单纯使用mNGS检测的情况下。另一方面,病毒和寄生虫的阳性mNGS检测不太可能是假阳性。

 

假阴性:16例(5.8%)患者出现假阴性(表2),结果显示与细菌、病毒和真菌感染有关。假阴性细菌感染病例均在测序前给予抗生素治疗。在病毒感染的假阴性病例中,SSRN数量为1或2个,这不满足之前mNGS阳性的建议标准。

 

如果将阳性结果的标准放宽到SSRN≥1 (RPM≥0.05),则无单纯疱疹病毒1型(HSV1)或水痘带状疱疹病毒(VZV)的假阴性,或HSV1、HSV2、VZV假阳性的病例。如果对病毒和结核分枝杆菌采用SSRN≥1(RPM≥0.05)的替代标准,可能会出现更多的假阳性,包括30例EBV、7例CMV(巨细胞病毒)和5例结核分枝杆菌感染。因此需要指出的是,这5例结核分枝杆菌感染的可能性不能从临床表现上排除,传统检测方法可能无法检测到结核分枝杆菌。

 

通过假阴性概率可以看出,患者如在检测前使用抗生素会影响细菌的检出率。在病毒检测的假阴性结果中可以看到低SSRN值(1或2个读数),表明当病毒SSRN指数低时,应该进行其他测试以确认诊断。因此作为筛选方法,mNGS检测到的病原体可为进一步诊断提供临床线索,即使结果不符合阳性结果的标准。

 

 mNGS技术在临床的应用如何影响医生的诊断?

 

作者根据实验结果,提出脑脊液mNGS在本研究的临床环境应用中,可以被认为是用于诊断CNS传染病的准一线方法。

 

mNGS测序技术,不仅可以检测预期之外的新微生物,更重要的是,mNGS可以检测到临床医生可能因非典型临床表现而未考虑到的病原体。此外,脑脊液mNGS不仅具有鉴定CNS感染新病因的能力,还可以检测到可能指导适当靶向治疗的意外共感染。最后,脑脊液mNGS可能是在对自身免疫性疾病的最终诊断之前,排除广谱潜在CNS传染病的适当工具。

 

关教授的研究中,超过三分之一的患者在48小时内首次通过脑脊液mNGS诊断,表明该技术对于快速临床决策非常有用

 

因此当患者出现以下情况时,脑脊液mNGS测序技术应被视为急性CNS感染的一线检测:

 

(1)患者病情危重并需要及时和精确的治疗;

(2)临床表现是非特异性的,并且联合其他传统检测用于识别致病原;

(3)需要排除广泛的潜在病原体以诊断疑似自身免疫性脑炎;

(4)怀疑罕见或新型病原体且无法通过传统检测方法查出致病原。

 

 局限

目前在临床环境中使用mNGS技术存在一些限制。首先,许多医院都没有现有的检测仪器,而且此类检测成本通常远高于其他传统检测方法。 其次,检测出某种病原体的DNA并不一定证明它就是患者的实际致病原。最后,mNGS无法检测出数据库中未包含的微生物。例如在关教授的本次研究中,实验设计未构建RNA文库,因此未能检测到RNA病毒。

 

结语 

脑脊液mNGS检测对于疑似中枢神经系统感染患者的诊断评估是非常有用的技术。 mNGS可以成为应对新出现的传染病和传染病爆发的一线实验室方法。若采用严格的mNGS阳性结果标准,并使用传统检测方法作为金标准,那么mNGS测序技术将会使更多医生和患者受益其中。


原文献ID

题目:Metagenomic Next-generation Sequencing of Cerebrospinal Fluid for the Diagnosis of Central Nervous System Infections: A Multicentre Prospective Study

期刊:BioRxiv     

发表时间:2019年6月

通讯作者:关鸿志

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