2019-08-12浏览量:141

『锐帮读』肝细胞癌早期筛查的血清代谢物标记物研究

肝细胞癌(HCC)是全球主要致命癌症之一,但由于早期隐性临床症状和与肝硬化鉴别诊断困难,HCC在高危人群中的早期诊断仍具有挑战性。目前影像学方法(如CT和超声)和血清生物标志物(如AFP)是临床上筛查和诊断HCC的常用方法,但缺乏早期筛查HCC的有效生物标志物,导致治疗效果不理想。本文研究从中国多个中心共招募了1448名受试者,采用基于液相色谱-质谱代谢组学方法对受试者血清代谢谱进行表征,筛选并验证HCC生物标志物。鉴定了包含苯丙氨酸色氨酸(Phe-Trp)和甘氨胆酸盐 (GCA)的血清代谢物组合,并验证比甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)在筛查肝癌和肝硬化的高危人群中有更好的诊断性能,而与AFP联合使用可提高预测临床前HCC的患病风险。除此之外,这个组合在鉴定S-HCC中,也比AFP有更好的效果。在测试集中,AFP中假阴性受试者中有80.6%可以用该代谢物组合明确诊断,并在验证集中得到验证。这个组合的特异度和生物相关性进一步利用另外两种癌症和HCC组织样本进行评估。

 

文献ID

题目:A Large-Scale, Multicenter Serum Metabolite Biomarker Identification Study for the Early Detection of Hepatocellular Carcinoma

译文:一项大规模多中心的血清代谢物生物标志物识别研究,用于早期检测肝细胞癌

期刊:Hepatology   IF:14.971

发表时间:2018.02

通讯作者:许国旺

通讯单位:中国科学院大连化学物理研究所

检测产品:LC-MS

 

 

研究思路

入组人群

本研究共有1448名受试者,包括对照组:健康志愿者,NC。疾病组:慢性乙型肝炎感染CHB、肝硬化Cir、肝细胞癌HCC、胃癌GSC和肝内胆管癌ICC患者,来自6个临床中心。

入组标准:肝脏生化异常者排除,有肝病史或其他系统性疾病病史者为健康对照,有急性肝病史或其他类型恶性肝病者归为肝病患者。

 

发现集(Discovery Set):共108人,用于发现标记物;

测试集(Test Set):共684人,用于评估标记物;

验证集1(Validaton Set-Cohort 1):共572人,包含150例慢性乙型肝炎感染(CHB)患者,用于验证标记物,并进一步构建回归模型;

验证集2(Validaton Set-Cohort 2):共 84人,包含新增加的临床诊断之前的42例HCC血清样本,和另42名与之匹配的高危对照者(患有乙肝病毒或肝硬化,但在随访期间没有HCC)的血清,为嵌套病例对照研究患者。

 

HCC的诊断通过超声、CT或磁共振成像进行确诊,且大多数病例通过组织病理学进一步诊断。根据门静脉高压或肝失代偿的临床证据诊断肝硬化。CHB经乙肝表面抗原存在6个月以上、乙肝病毒DNA 浓度大于105拷贝/ mL以及天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶水平升高被确诊。且尽可能匹配各组间的性别和年龄分布,详细信息见表1。

 

表1 每组受试者的临床特征

 

血清标本采集

在禁食一晚后,于早上6:00-8:00采集血清样本,以消除饮食干扰。然后所有样品立即储存在-80℃冰箱中,在分析前于冰上解冻。

 

组织预处理

收集50例HCC患者的HCC组织(HCC tissues ,HCT)、配对的癌旁非癌组织(距肿瘤2 cm)和癌旁远端非癌组织(距肿瘤5 cm)。用LC-MS检测这些组织的代谢谱。

 

研究成果

1、研究队列的人口统计

研究流程如图1所示。为了确定候选的生物标志物,发现集中共收集了108份血清样本。而测试集共有684名参与者(包括325名HCC患者),被招募来测试这些候选生物标志物和鉴定出的潜在生物标志物。测试集中的小肝癌(small HCC,S-HCC)患者(单结节型HCC或含不超过两个直径小于3cm的结节)被用于评估代谢物生物标记物的在早期HCC中的诊断潜力。325例HCC患者中,92人(28%)被诊断为S-HCC。

 

另外,本研究采用572人的独立队列(验证集1),其中NC 99例、CHB 143例、Cir 150例、HCC 155例、ICC 25例,建立代谢物组合模型并评价其诊断效果。最后,将建立的模型应用于验证集2(来自42例HCC新病例和42例与之相匹配的高危对照人群),以评估鉴定出的HCC临床前生物标志物组合的预测疾病能力。所有受试者的临床资料见表1。

 

2、血清代谢谱

在发现集和测试集的主成分分析评分图中,QC样本紧密地聚在一起,证明了本研究的可靠性(图2)。此外,来自NC组、Cir组和HCC组的样本间的分离趋势显示这些组间存在显著的系统代谢差异。最后,在前期研究的基础上,对自建数据库(包含2000多个代谢物标准品)和在线数据库(HMDB和Metlin)进行了检索,或者用标准品进行鉴定,最终确定了239个代谢物。

 

图2 发现集(A)和测试集(B)的PCA评分图

 

3、HCC潜在代谢标志物的鉴定

首先,PLS-DA分析评分图显示,在发现集中这些组之间存在明显的分离(图3A),且没有过度拟合(图4)。将57个在两个主成分上均VIP >1.0的代谢产物作为重要变量进行分类(图3B),随后使用单变量分析发现,HCC组分别与NC组、Cir组相比,57种代谢物中共有17种代谢物的差异P <0.05且FDR<0.05(图3C)。

 

在684人的测试集(图1)评估这17个候选生物标志物的可靠性,必须满足以下标准:(1)四种比较方案(HCC与NC比较、HCC与Cir比较、S-HCC与NC比较、S-HCC与Cir比较)中存在显著差异,(2)同时保持与发现集相同的变化趋势。最终保留了8种代谢产物:苯丙氨酸色氨酸(Phe-Trp)、甘氨胆酸盐 (GCA)、牛磺胆酸盐、溶血磷脂-乙醇胺18:2、20:5、22:4、以及胆碱和牛磺酸。

 

随后,利用这8种潜在代谢物生物标志物,采用二项逻辑回归分析和正演逐步优化算法构建最佳模型。最后,Phe-Trp和GCA(图3D、E)被确定为区分HCC患者和非HCC患者的理想生物标志物组合。

 

图3 肝细胞癌潜在代谢标志物的鉴定

 

图4 置换检验分析图

 

该代谢物组合的诊断性能明显高于AFP。在发现集和测试集中,代谢物组合和AFP筛查HCC与Cir的AUC值比较分别为0.930 vs 0.892、0.657 vs 0.725(表2)。此外,与AFP相比,血清代谢物组合在测试集中从Cir高危人群中识别S-HCC患者具有更高的灵敏度和相似的特异度(80.2% vs 45.3%、78.4% vs 78.4%)(表2)。而且,采用代谢物组合能够准确诊断AFP中的假阴性HCC和S-HCC患者的准确率分别为80.6%和74.5%(图5B)。

 

表2 测定血清代谢组合、AFP或结合两者在HCC诊断中的结果

图5 血清代谢物组合(2-Meta)、AFP在HCC和S-HCC诊断中的表现

 

4、HCC生物标志物组合的验证

为了验证该血清代谢物组合对HCC检测的诊断潜力,使用了来自另一个独立队列(验证集1)的572个样本,其中有150例慢性乙型肝炎感染(CHB)患者被纳入这一队列。应用同位素标记定量法测定血清的Phe-Trp和GCA浓度,通过逻辑回归模型构建代谢组合。方法学验证表明,该方法定量可靠,可用于检测血清中的Phe-Trp和GCA浓度。最后,构建了用于HCC检测的代谢组合方程为:logit[P=HCC]=–23.323×[Phe-Trp]+0.007×[GCA] + 1.727。

 

类似于发现集和测试集的结果,该代谢组合比AFP显示出更高的诊断性能,不仅能从Cir人群中鉴定出HCC,还可以进一步鉴定出S-HCC(AUC值分别为0.807 vs 0.650、0.753 vs 0.676)(表2)。而且,采用代谢物组合能够准确诊断AFP中的假阴性患者(AFP中HCC和S-HCC患者的假阴性率分别为90.5% 和75.0%)(图5C)。

 

采用验证集2进一步评价了上述构建的代谢组合模型。该代谢组合对进展为HCC但临床诊断前未发生HCC的患者的鉴定灵敏度(范围为80.00% -70.3%)高于AFP(范围为40.00% -26.2%)(表3)。此外,该代谢物组合对HCC临床前诊断的灵敏度在3~1年的时间内持续增加(从71.4%到80.0%),而其特异度(范围47.6%-80.0%)在临床诊断前的每个时间点均低于AFP(范围100%-93.8%)。与AFP联合治疗相比,特异度略有提高,但灵敏度相似(表3)。

 

此外,在临床诊断前1年,与高危对照组相比,临床前HCC患者的 Phe-Trp和GCA水平发生了显著变化,其变化与HCC患者在发现集和测试集中与对照组相比的变化一致(图3D,E)。这些结果表明,该血清代谢物组合具有在临床诊断前从高危人群中筛选出HCC的潜力。

 

表3 血清代谢物组合、AFP或两者在肝细胞癌临床诊断前一年预测HCC的表现

 

而另外两种癌症,GSC和ICC,被特别纳入本研究中以评估这些HCC潜在生物标志物的特异性。与GSC或ICC组相比,HCC组血清Phe-Trp水平显著下降,而GCA水平显著升高(图3D,E)。此外,这两种代谢物的组合能将HCC患者与GSC患者和ICC患者区分开来,AUC分别为0.946和0.829(图6),表明这个代谢组合对HCC鉴定具有特异性。

 

图6 血清代谢物组合对HCC与其他两种癌症的鉴定诊断性能。测试集和验证集上,本组HCC患者与GSC(A)、ICC(B)患者的ROC曲线的比较。

 

5、生物标志物组合与HCC临床特征的关系

 

 

图7  HCC相关的差异代谢物通路分析

 

对这些差异代谢物的含量与临床特征进行相关性分析,以更好地了解血清代谢物谱与HCC表型之间的关系。研究发现几种胆汁酸水平与天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素水平呈正相关,与总蛋白、清蛋白水平呈负相关。而Phe-Trp、血清素、肌醇、胆碱、牛磺酸等水平与临床特征呈负相关。显然,这些不同代谢物的水平与BMI、AFP水平、年龄和性别无关(图8A)。研究还发现这两种生物标志物在乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染之间没有差异。

 

图8 HCC诊断中生物标志物的生物学相关性

 

进一步揭示HCC患者这些标记物的生物相关性,对之前研究中50例HCC患者中成对的HCC组织(HCC tissue,HCT)、相邻的非癌变组织(ANT)和远端非癌变组织(DNT)标本进行研究。发现相比DNT,HCT中Phe-Trp水平明显下降(图8B),并且伴随着高浓度的色氨酸和苯丙氨酸(图9)。而肿瘤组织中几种胆汁酸水平明显降低(图8C、图9)。

 

图9  DNT、ANT、HCT肝组织中与胆汁酸、 Phe-Trp相关的差异代谢物的直方图

 

 

研究结论

1、本研究共招募了来自中国6个临床中心的1448名参与者,采用发现、测试、验证三步分析策略,对这些新型生物标志物的临床实用性进行识别和验证;

2、此外还特别招募了S-HCC患者来评估生物标志物在早期HCC诊断中的表现;

3、并通过一项嵌套病例对照研究,前瞻性地收集临床前HCC患者和临床诊断前高危对照者的血清,评估这些已发现的HCC生物标志物的预测能力;

4、在另外两种癌症:胃癌(GSC)和肝内胆管癌(ICC)的比较中,评估这些潜在的HCC生物标志物的特异性,最后利用HCC组织标本进一步评价这些生物标志物的生物学相关性;

5、将差异代谢物进行通路分析,找到与HCC相关的代谢通路信息。

 

 

亮点

本文章多中心代谢组学研究为使用少量血清筛选HCC生物标记物提供了一种实用的策略,发现了一组代谢物可有效应用于HCC筛查,其诊断性能优于常规方法AFP。且在HCC患者中较其他癌症显示出较高的特异性。这对临床前HCC患者的监测具有重要意义,显示了该组代谢物在HCC诊断的临床实践中的潜力。

 

 

锐翌基因科服产品

锐翌基因科服产品多元化,包括微生物组测序产品(16S/ITS扩增子、宏基因组、宏转录组和单菌基因组)、转录调控产品(原核转录组和真核转录组)和代谢组产品(非靶向代谢组和靶向代谢组),多组学结合分析,有助于高等院校、科研机构或医院的科研工作者多角度、全面的探究和解决科学问题,助力更多优质科研成果发表。

 


下一篇